PCR、原位杂交相比，原位PCR有什么优势和不足？

PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位，因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系，这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力，但由于其敏感性问题，尤其是在石蜡切片中，尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。

而原位PCR可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位，从而弥补了PCR和原位杂交的不足，因此它的优势是显而易见的。

一文读懂基因测序技术的前世今生

随着人们对自身基因遗传信息的了解和掌握，使得基因检测技术不断发展和完善，基因检测技 术也得到了迅猛发展，下面就和小编一起看看这些年测序技术的发展历程。 测序技术的每一次变革，都是对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发等领域的巨大推动作用。

从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法），发展至今三十多年时间，测序技术已取得 了相当大的发展，从第一代到第三代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来 第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三测序技术也已在 这一两年的时间中快速发展着。 根据原理的不同，人们将测序技术发展分为三个阶段，第一代，sanger测序。第二代，高通量 测序（NGS）。第三代，单分子/纳米孔测序。由于三代测序技术各有优缺点，应用的领域也 不尽相同，第一代测序技术仍未被淘汰，目前的测序市场是三代测序技术并存的局面。

第一代：sanger测序

第一代测序技术，主要基于 Sanger双脱氧终止法的测序原理，结合荧光标记和毛细管阵列电 泳技术来实现测序的自动化，基本方法是链终止或降解法，人类基因组计划就是基于一代测序 技术。第一代的Sanger测序技术的优点是，测序读长长，能达到800-1K bp，且测序用时短，只需要几十分钟即可完成一次测序，测序准确度高准确性高达99.999%，目前仍是测序的 金标准；

缺点是通量低、成本高，影响了其真正大规模的应用。

因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的 454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技 术诞生了。

第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1 周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。

第二代：高通量测序（NGS）

高通量测序技术（又称为下一代测序，Next Generation Sequencing，NGS）自2005年454 公司推出第一台基于焦磷酸测序二代测序仪开始，到2017年Illumina推出NovaSeqTM系列， 高通量测序技术经历了十几年的技术发展过程，NGS测序平台也经历了一系列的收购和合并， 最终形成主要三家测序平台，包括：Illumina的Solexa平台、Life Technologies的 Ion Torrent平台和华大基因的Complete Genomics平台。

1.Illumina平台

由于其技术成熟，平台之间高度互补性与交叉性，使得其在短读长测序上大占优势，是目前应 用最广泛的NGS平台。目前其占据了测序仪市场约70%的市场份额。

2.Life Technologie平台

Life公司Ion Torrent测序平台采用的为半导体测序原理，其在非碱基多聚体（nonhomopolymer）的测序上正确率与其它NGS平台相差无几，而对于连续碱基的检测还不够完 善，在检测同一碱基连续出现时的数量可能会有所误差。相对于其他平台，测序通量较小，平 台数量也较少。

3.Complete Genomics平台

Complete Genomics平台采用了高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，然后 用复合探针-锚定分子连接（cPAL）技术来读取碱基序列。虽然这些技术非常准确，但该技术 在应用上最大的限制可能就是其过短的读长。

高通量测序技术经历了十几年的飞速发展，人类基因组测序成本已经从人类基因组计划的约30 亿美元降到了1000美元左右。目前二代测序设备在通量、准确度上都有了较大的提高，同时 测序成本也随之大幅度下降，成为商用测序的主流。

第三代：单分子/纳米孔测序

测序技术在近两年中又有新的里程碑，Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、Pacific Biosciences公司的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子技 术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序，测序过程 无需进行PCR扩增，其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单 分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。

由于第二代技术存在短读长和耗时长的缺陷，人们希望第三代测序技术能解决这些缺陷，第三 代测序技术通过现代光学、高分子、纳米技术等手段来区分碱基信号差异的原理，以达到直接 读取序列信息的目的，三代测序设备在DNA 序列片段读长上优于二代设备，但在准确度上较 二代设备差，目前尚未完全成熟，市场应用面还不算广，未来随着技术的改善，三代测序设备 将更为稳定和成熟。

第三代测序优势：

1）第三代基因测序读长较长，如Pacific Biosciences 公司的 PACBIO RS II 的平均读长达到 10kb，可以减少生物信息学中的拼接成本，也节省了内存和计算时间。

2）直接对原始DNA样本进行测序，从作用原理上避免了 PCR 扩增带来的出错。

3）拓展了测序技术的应用领域，二代测序技术大部分应用基于DNA，三代测序还有两个应用 是二代测序所不具备的：第一个是直接测RNA的序列，RNA的直接测序，将大大降低体外逆 转录产生的系统误差。第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚合酶复制A、T、 C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同，根据 这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。

4）三代测序在ctDNA，单细胞测序中具有很大的优势：ctDNA含量非常低，三代测序技术灵 敏度高，能够对于1ng以下做到监测；在单细胞级别：二代测序要把DNA提取出来打碎测序， 三代测序直接对原始DNA测序，细胞裂解原位测序，是三代测序的杀手应用。

第三代测序缺陷：

1）总体上单读长的错误率依然偏高，成为限制其商业应用开展的重要原因；第三代基因测序 技术目前的错误率在15%-40%，极大地高于二代测序技术NGS的错误率（低于1%）。不过好 在三代的错误是完全随机发生的，可以靠覆盖度来纠错（但这要增加测序成本）。

2）三代测序技术依赖DNA聚合酶的活性。

3）成本较高，二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每 100万个碱基0.33-1.00美元。

4）生信分析软件也不够丰富。

三代测序和二代测序相比较，第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提 升，但缺点是所引入PCR过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时 读长也比较短。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单 分子测序，不需要任何PCR的过程，这是为了能有效避免因PCR偏向性而导致的系统错误，三 代读长超长，准确低，费用高，但因读长长，利于组装和发现unique reads潜在优势明显，但 是劣势也限制了三代测序的商业应用。

未来前景

目前，第二代的基因测序技术高通量测序（NGS）是市场商用主流。

第三代的单分子/纳米孔 测序将是未来的大势所趋，但是预计在将来5-10年内二、三代基因测序会共存，但二代测序仍 将是测序市场商业应用主流