Product Details and Specifications | ||
Product Name | human testis cDNA | |
Product Catalog Number | cDNA-hsa-06 | |
Components | Each kit contains 20 ul of 100 ng/ul cDNA, sufficient for 20 PCR reactions. | |
Storage Conditions | Store DNA at -20 degrees Celsius | |
Shipping Conditions | Our cDNA libraries are shipped at room temperature via overnight delivery. Please note that additional shipping charges may apply. |
biosttia是一家总部位于圣地亚哥的公司,提供分子生物学产品和服务,支持全球的研究人员。利用我们高效的慢病毒系统,我们协助许多学术机构、生物技术和制药公司进行基因表达和抑制相关研究。Biosettia专门从事:shRNA载体系统的基因沉默慢病毒miRNA对基因的抑制作用慢病毒miRNA的功能筛选miRLocker–慢病毒miRNA抑制慢病毒的制备慢病毒基因表达诱导多能干细胞生成核酸纯化
RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程,该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。沉默机制可导致由小干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解,或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。通过几种蛋白的活性(下面讨论),通过短反义核酸(siRNA和shRNA序列)锁定细胞mRNA,从而实现其随后的降解。这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集,导致其水平的下降,最终实现抑制作用。[放大]图1. siRNA和shRNA结构。(A)siRNAs是短的RNA双链,在3‘端有两个碱基的游离。(B)shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。(C)shRNA构建用于插入表达载体。源自[1, 2]。背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。1993年,Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。然而,直到1998年,Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果,他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。最终确定小RNA途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA干扰途径一样。表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。
表一总结了RNA干扰机制的主要元件。它们包括锁定靶基因的双链RNA(siRNA或shRNA)、Dicer酶,Argonaute蛋白家族的蛋白质(具体来说是Ago-2)、Drosha、RISC、TRBP和PACT。术语描述siRNA小干扰(siRNA),有在3’端有两个碱基的游离,可激活RNA干扰,通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。shRNA短发夹RNA(shRNA),包含一个环结构,可加工成siRNA,也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解.Drosha是一种核糖核酸酶III的酶,可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA。Dicer核糖核酸酶III酶,能够将双链RNA加工成在3‘端有两个碱基游离的20-25bp的siRNA。果蝇的Dicer-2能够剪切长的双链RNA,而Dicer-1对miRNA的加工有重要作用RISC最小RNA诱导沉默复合物(RISC)包含Argonaute蛋白和相关的siRNA。也可能包含PACT、TRBP和Dicer。需要注意的是RISC的组成尚未能得到确切的描述。TRBPDicer剪切双链RNA以及随后转运给RISC的过程中需要PACT蛋白R(PKR)-激活蛋白(PACT)。Dicer和TRBP参与双链RNA剪切相关.Argonautefamilyofproteins和单链的RNA(siRNA)共同组装形成RISC。绑定21-35个核苷酸的RNA,包括miRNA和siRNA以及相关的靶mRNA,然后通过其内切核酸酶功能发挥剪切作用。剪切作用发生在反义链(引导链)RNA的第10th和第11th个核苷酸之间。表一:RNAi机制的主要组成元件。siRNA vs. shRNA作用机制两个在RNAi途径的基因沉默中具有实质利害关系的是双链小干扰RNA(siRNA)和基于载体的短发夹RNA(shRNA)。虽然siRNA和shRNA(图1)都可用于蛋白沉默,但它们的作用机制有所不同(图2)。不管是长的双链RNA还是短的约21bp碱基对的双链都能够直接被转运到组织培养的细胞中(参见转运机制获取更多细节)。虽然有一些报道提到siRNA在转染细胞时是被转运到细胞核中的,但更普遍的看法是它们在细胞质中聚集。长的双链RNA与Dicer一起形成复合物,双链特异性的核糖核酸酶III能够将它们处理成带有两个游离碱基的长度为21-23nt的siRNA。随后这些siRNA片段与RISC结合,RISC由Argonaute-2(Ago-2)、Dicer和TAR-RNA-结合蛋白(TRBP)组成。然后RNA的两条链分开,其中一条链从复合物上分离。5"端双链稳定性最低的那条链被选择出来,稳定的并入沉默复合物中。[放大]图2. RNAi介导的基因沉默机制。在细胞核表达后,shRNA被Drosha加工然后由Exportin-5蛋白转运到细胞质中,在细胞质中它们与Dicer结合去除环状序列。在这一点上,它们与siRNA的加工方式(以短的双链形态导入细胞,然后被Dicer识别)相同。在与RISC结合并去掉其中一条RNA链后,它们识别mRNA占有互补序列,导致其降解。源自[3]。shRNA在转染/转导细胞的细胞核中的合成,形成发夹结构,茎区成对的反义和正义链与未配对的成环核苷酸连接在一起(图1b和1c)。通过与miRNA的加工相同的RNAi机制,shRNA被加工成siRNA。使用细菌或病毒载体,shRNA被导入靶细胞的细胞核内,在某些情况下,载体可以稳定地整合到基因组中。根据驱动表达的启动子的不同,shRNA可被RNA聚合酶II或者III催化转录。在被Exportin-5转运到细胞质之前,这些初始的前体结构需要首先用Drosha及其双链RNA结合伴侣DGCR8加工形成pre-shRNA。pre-shRNA随后被Dicer和TRBP/PACT酶切,去除发卡结构,产生在两个3‘末端带有两个游离碱基的20-25nt的双链siRNA。这一有活性的siRNA随后被整合到沉默复合物上去。一旦被整合到RISC后,shRNA和siRNA识别靶mRNA和降解的过程基本上是相同的。作为RISC的一部分,siRNA通过碱基互补配对以序列特异性的方式结合到靶mRNA,从而利用Ago-2的核酸酶H样活性裂解靶RNA的双链中心附近的磷酸骨架。某些生物的这个系统有一个有趣的特点,siRNA与靶mRNA的退火使siRNA作为引物,而靶mRNA作为依赖于RNA的RNA聚合酶的模板。这就合成出一个新的双链RNA,然后由Dicer酶加工,形成正反馈循环,增加了siRNA的量。应当指出的siRNA通常需要完全同源才能诱导降解。该过程图2中有阐述。人们对RISC发现靶mRNA的过程还没有很好的理解。然而,Ameres等的报告显示细胞mRNA的靶序列的亲近性影响了它的剪切。他们还指出,RISC不是作用于未折叠的RNA。他们提出了一个模型,在该模型中,RISC非特异性的方式通过随机扩散与单链RNA接触,5"末端碱基配对比3"末端更有效率。这似乎决定了RISC与靶mRNA的稳定结合。
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第一次养胚胎干细胞,复苏的时候复苏到六孔板中的其中一个孔中,结果发现细胞很多,于是换了两个6cm皿养,结果越养越少。很纳闷。请教了几位蚂蚁淘的前辈们,于是乎有几个问题还是在心中,希望还能在这里能得到答复。
1。培养细胞的时候是一定要在六孔板中吗?那一般复苏细胞的时候复苏到几个孔中呢?
2.细胞的密度是大概多少呢?
3.我用的基质胶,说明书上是1;80,结果在孵箱放了一小时后,发现没有想象的胶凝固的样子,没有像果冻那样。反而还是液体状的,这是能用还是不能用呢?
4.如果基质胶一开始就铺好,等到传代的时候再铺,中间每天都在换液,不容易污染吗?
5。刚复苏的细胞,一直漂浮在培养液里,是慢慢地细胞才会贴在基质胶上么,然后才会慢慢在基质胶上生长么?
全能干细胞具有能发育成各种组织器官的完整个体的潜能的细胞,如胚胎干细胞。多能干细胞没有发育成完整个体的能力,但具有分化出多种细胞组织的能力,主要在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值,多能干细胞还在研究当中,过去认为多能干细胞只能从人胚胎中获得,现在已能用体细胞转化为多能干细胞。
单能干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞。
一般细胞没有自我复制能力,而且也不会分化。
原代培养效果很好,第四天便成典型梭形鱼群状生长;第六天传代
但传代后细
胞形态发生改变,属于正常吗,请大神知道,初次培养;万分感谢
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