40bp寡核苷酸连接如何连接到载体上？
2016-04-18
问题描述：
各位战友，你们好！我最近在做载体构建的实验，我打算将一段40bp左右的寡核苷酸连接到载体上，但是做了几次都是阴性结果，求各位大神指教！谢谢
我的操作过程如下：
我是将含有酶切位点的寡核苷酸引物稀释成100uM，各取1ul，加8ul水，95℃5mins，然后自然冷却至室温，然后再将退火后的核苷酸双链稀释了100倍。稀释后的核苷酸双链进行双酶切，酶切体系是：
10xBuffer4ul
Oligo30ul
酶12ul
酶22ul
ddH2O2ul
混匀后37℃水浴40min，在用65℃将酶变性20min
接下来就将寡核苷酸与双酶切回收载体连接（确认已经酶切开）
连接体系：
载体：2ul
oligo：10ul
10xT4buffer：2ul
T4连接酶：2ul
ddH2O：4ul
16℃连接过夜。
转化克隆后，挑取单克隆测序，发现全是没有连上，可能是什么原因呢？能帮忙解答一下吗？
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细胞君爆发中
用户
自己顶起来，问题还没有解决，有经验的哥哥姐姐们，求分享！
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mpark
用户TrytorunnativePAGEtopurifythetwo40meroligomers.Havethetwopurified40meroligomers(2umeach)reannealed.DONOTcutwithenzyme,andligatewithvectorwhichhasbeencutwithEcoRV,orSmaI,orStuI,orcutwithanyuniqueenzymeandbeenbluntended.Setligationatroomtemperatureandincubatetheligationovernight.Make1:3dilutionoftheligationwithsterilizedddH2O,anduse3-5ulofthedilutedligationfortransformation.Make12-15miniprepesandrunDNAsequencetoidentifythepositiveclone.
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细胞君爆发中
用户展开引用mparkTrytorunnativePAGEtopurifythetwo40meroligomers.Havethetwopurified40meroligomers(2umeach)reannealed.DONOTcutwithenzyme,andligatewithvectorwhichhasbeencutwithEcoRV,orSmaI,orStuI,orcutwithanyuniqueenzymeandbeenbluntended.Setligationatroomtemperatureandincubatetheligationovernight.Make1:3dilutionoftheligationwithsterilizedddH2O,anduse3-5ulofthedilutedligationfortransformation.Make12-15miniprepesandrunDNAsequencetoidentifythepositiveclone.谢谢您的建议，我想问一下您几个问题。1.在将40mer的寡核苷酸退火时，需不需要磷酸化？退火缓冲液直接用水可以吗？需不需要加Nacl，EDTA,Tris-Cl等？2·您说的连接反应是在室温连接过夜吗？25℃条件下过夜会不会有影响，我之前查了相关资料，有老师说室温左右连接最好不要超过3个小时，不然寡核苷酸末端会丢失影响连接效果，会不会存在这样的问题？......
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mpark
用户Donothavetheoligomersphosphorylated.Add5MnaClinreannealingsolutiontoafinalofconcentration150-200mM.25Cligatinoovernightisperfect.Iftheoligomersarenotpurified,itcouldhappenforpoorligation,butnotduetonucleotidesbrokenaway,insteadduetonon-bluntendeddouble-strandedoligomers..
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细胞君爆发中
用户展开引用mparkDonothavetheoligomersphosphorylated.Add5MnaClinreannealingsolutiontoafinalofconcentration150-200mM.25Cligatinoovernightisperfect.Iftheoligomersarenotpurified,itcouldhappenforpoorligation,butnotduetonucleotidesbrokenaway,insteadduetonon-bluntendeddouble-strandedoligomers........谢谢mpark的建议。
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future007
用户我连过一个40bp的片段，不过，用的是无缝克隆的方法。阳性率高，推荐你用，至于试剂盒，我就不打广告了，一搜一大片。别买进口的就行。太贵
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lqz816
用户个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗
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用户lqz816个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗您好，谢谢您的答复，按照你说的最终连接浓度时1pmol/ul即1umol/L的浓度。而我之前的操作到连接反应时的你那浓度时0.5pmol/ul。所以应该跟您说的浓度差不多，但是的确有点稀。我做酶切是因为我在设计oligo时在末尾加了酶切位点跟保护碱基，我怕不酶切会影响它与酶切后线性载体的连接，就先进行了酶切，在通过高温孵育的方式将酶灭火。
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细胞君爆发中
用户future007我连过一个40bp的片段，不过，用的是无缝克隆的方法。阳性率高，推荐你用，至于试剂盒，我就不打广告了，一搜一大片。别买进口的就行。太贵哦哦，没听说可以用试剂盒，可以私信一下您用的是哪个公司的试剂盒吗？
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lqz816
用户展开引用细胞君爆发中lqz816个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗您好，谢谢您的答复，按照你说的最终连接浓度时1pmol/ul即1umol/L的浓度。而我之前的操作到连接反应时的你那浓度时0.5pmol/ul。所以应该跟您说的浓度差不多，但是的确有点稀。我做酶切是因为我在设计oligo时在末尾加了酶切位点跟保护碱基，我怕不酶切会影响它与酶切后线性载体的连接，就先进行了酶切，在通过高温孵育的方式将酶灭火。......可以在设计接头时把酶切位点互补序列设计成悬挂/突出末端，这样可免片段酶切步骤，直接退火后连到酶切好的载体上，有时加保护碱基酶切效率不见得就高
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ilaveu
用户展开引用lqz816细胞君爆发中lqz816个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗您好，谢谢您的答复，按照你说的最终连接浓度时1pmol/ul即1umol/L的浓度。而我之前的操作到连接反应时的你那浓度时0.5pmol/ul。所以应该跟您说的浓度差不多，但是的确有点稀。我做酶切是因为我在设计oligo时在末尾加了酶切位点跟保护碱基，我怕不酶切会影响它与酶切后线性载体的连接，就先进行了酶切，在通过高温孵育的方式将酶灭火。可以在设计接头时把酶切位点互补序列设计成悬挂/突出末端，这样可免片段酶切步骤，直接退火后连到酶切好的载体上，有时加保护碱基酶切效率不见得就高......没错，设计成突出末端，退火之后直接连接，我自己配的退火buffer，这样的方法改载体，我用了很多次，几乎每次都是100%的成功。
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lqz816
用户展开引用细胞君爆发中lqz816个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗您好，谢谢您的答复，按照你说的最终连接浓度时1pmol/ul即1umol/L的浓度。而我之前的操作到连接反应时的你那浓度时0.5pmol/ul。所以应该跟您说的浓度差不多，但是的确有点稀。我做酶切是因为我在设计oligo时在末尾加了酶切位点跟保护碱基，我怕不酶切会影响它与酶切后线性载体的连接，就先进行了酶切，在通过高温孵育的方式将酶灭火。......我算错了，的确是浓度不低了，你的退火体系为什么不加盐呢?我们退火时加到100mM氯化钠。如果退火效率差加上酶切效率也差，连接不上也很正常
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lqz816
用户展开引用细胞君爆发中lqz816个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗您好，谢谢您的答复，按照你说的最终连接浓度时1pmol/ul即1umol/L的浓度。而我之前的操作到连接反应时的你那浓度时0.5pmol/ul。所以应该跟您说的浓度差不多，但是的确有点稀。我做酶切是因为我在设计oligo时在末尾加了酶切位点跟保护碱基，我怕不酶切会影响它与酶切后线性载体的连接，就先进行了酶切，在通过高温孵育的方式将酶灭火。......再则你直接取酶切体系且占一半连接体积用于连接也不妥，盐干扰连接，里面的酶切下来的短片段又会与载体竞争目的片段而且量又比载体大得多得多，估计连接后大多又变成了原先酶切前的片段
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细胞君爆发中
用户展开引用lqz816细胞君爆发中lqz816个人认为寡核酸片段太稀了吧，我们做接头时弄的浓度是50pmol/ul,稀释1pmo左右连，搞不清你为啥要酶切，设计时不能弄成突出末端吗您好，谢谢您的答复，按照你说的最终连接浓度时1pmol/ul即1umol/L的浓度。而我之前的操作到连接反应时的你那浓度时0.5pmol/ul。所以应该跟您说的浓度差不多，但是的确有点稀。我做酶切是因为我在设计oligo时在末尾加了酶切位点跟保护碱基，我怕不酶切会影响它与酶切后线性载体的连接，就先进行了酶切，在通过高温孵育的方式将酶灭火。再则你直接取酶切体系且占一半连接体积用于连接也不妥，盐干扰连接，里面的酶切下来的短片段又会与载体竞争目的片段而且量又比载体大得多得多，估计连接后大多又变成了原先酶切前的片段......好的，我试试哈，谢谢！
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kangaroo0513
用户future007我连过一个40bp的片段，不过，用的是无缝克隆的方法。阳性率高，推荐你用，至于试剂盒，我就不打广告了，一搜一大片。别买进口的就行。太贵你的意思是，不算同源臂40bp么？算同源臂的话70-80-bp？
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