按大小分离RNA：在含有甲醛的琼脂糖凝胶上进行的RNA的电泳
| 实验方法原理 | RNA样品经甲酰胺处理以及经含有甲醛的凝胶电泳分离可能会发生变性，这一方法是从Lehrachetal.(1977),Goldberg(1980)，Seed(1982a）和Rosenetal,(1990)修改而来。RNA在含有2.2mol/L甲醛的凝胶上电泳分离。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | RNA样品RNA大小标准参照物 试剂、试剂盒 | 溴化乙锭甲醛甲酰胺甲醛凝胶电泳加样缓冲液MOPS电泳缓冲液 仪器、耗材 | 琼脂搪凝胶水平电泳仪透明直尺水浴 实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液与溶液 溴化乙锭（200μg/ml) 甲醛 甲酰胺 10X甲醛凝胶电泳加样缓冲液 10XMOPS电泳缓冲液 2.凝胶 含有2.2mol/L甲醛的琼脂搪凝胶 3.核酸和寡核苷酸 RNA样品 RNA大小参照物 4.专用设备 水平电泳仪 透明直尺 55℃水浴 二、方法 1.在一灭菌的微量离心管建立变性反应 RNA（多达20μg） 2.0μl 10XMOPS电泳缓冲液 2.0μl 甲醛 4.0μl 甲酰胺 10.0μl 溴化乙锭（200μg/ml） 1.0μl 2.盖紧微量离心管的盖子，于55℃温育RNA液体60min，在冰水中冷却样品10min，然后离心5s并将所有的液体在微量离心管的底部沉淀。 3.加2μl10X甲醛凝胶加样缓冲液并将试管重新置于冰上。 4.将琼脂糖/甲醛凝胶装入水平电泳槽中，加入足够1XMOPS电泳缓冲液覆盖凝胶约1mm。电泳5min(5V/cm)。加RNA样品到凝胶加样孔中，将空胶两侧的两条最外侧的泳道留下，加样RNA标准大小参照物。 5.凝胶浸入1XMOPS电泳缓冲液中，4~5V/cm电压下进行电泳，直到溴酚蓝移出约8cm(4~5h)。电泳时用较高电压会导致条带模糊不清。因为电泳缓冲液的pH值在电泳过程中会发生变化，装好电泳槽，缓冲液通过蠕动泵不断从一个室到另一个室。每隔一个小时更换一次缓冲液。 6.将凝胶放置于一片Saran膜上在紫外线透射仪上观察RNA将染色凝胶和紫外线透射的照片用透明的直尺对比。 7.照像并测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RNA片段大小的对数值对RNA条带的适移距离作图，用所得曲线计算从凝胶转移到固相支持体后通过杂交计算出RNA分子的大小。 8.通过上或下毛细管转移固相化的RNA到固相支持物上。 |
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发布于 ： 2018-08-08
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