| 实验步骤 | 一、典型的方案对于上清液组分，可在低速(S10)或高速(S100)的条件下进行上样。一般更倾向于在高速条件下上样，因为可以排除核糖体或微粒体的干扰。所用层析柱的大小取决于样品量的多少。一个有用的经验方法则是样品中每100mg蛋白质用ImL填装凝胶(50〜100目）。依据生产厂商(Bio-Rad，Bulletin1107)提供的说明，ImL填装的Affi-GelBlue可结合11mg白蛋白。一般地，在上述条件下，仅有总蛋白质的5%〜10%蛋白质可结合于柱上，所以，这里建议的蛋白质与凝胶量的比例足矣。然而，对于每种提取物，都应该对流穿物质采用特异性分析以确保目标蛋白质完全结合于层析柱。若不能进行上述分析， 我们发现一种缓冲液作为起始的层析用缓冲液和适当的稳定剂比较有效，其配方为含有0.Imol/LKCl的10mmol/LTris-HCl，pH7.5。样品应适应0•ImoI/LKC1。与上述情况类似，该配方条件下，也同样只有不到总蛋白质10%的蛋白质量结合于层析柱。而且，未结合的核酸会被清洗下来。完成上样之后，继续采用相同的溶液清洗层析柱，直至洗脱液A280ra^止下降。再采用含Imol/LKCl的相同缓冲液分批洗脱目标蛋白质和结合的蛋白质。尽管还是会观察到一些拖尾现象，但是通常运行2个柱体积的缓冲液足以将大多数蛋白质洗脱下来。多数情况下，这种通用程序已经可以足够去除大多数的核酸，使样品得到浓缩,并使目标蛋白质得到5〜10倍的纯化。 也可改良该方案以适于更多种样品的纯化。用含有一定浓度KCl的溶液进行中间洗脱步骤，该浓度下能够尽量去除外源性蛋白质,而不是目标蛋白质。之后，可以采用最低浓度KCl洗脱目标蛋白质，同时必须使其他外源性蛋白质仍处于结合状态。这种增强型方案需要进行反复的洗脱实验,也会有失败的情况，但通常可以使目标蛋白质达到20倍的纯化。某些情况下，目标蛋白质可能与层析介质结合得十分紧密，因而需要更强的洗脱条件。我们发现Imol/LKBr是一个不错的选择，但是，所得的洗脱液应快速进行透析处理，因为可以导致某些蛋白质变性。或者可以选择将KCl的浓度增加到2md/L，可能会获得良好效果。 Mi-GelBlue层析柱可以进行重复使用，但是该柱也应采用若干个柱体积的2mol/L盐酸胍或1.5mol/L硫氰酸钠进行再生处理，然后用初始的缓冲液进行平衡。随后可向该层析柱加入叠氮化钠，于低温储存。在上述条件下，层析柱和树脂均可稳定地保存数年。 |
|---|
