―、材料与设备

1.全长含核苷酸类似物的RNA合成

所有的缓冲液配制均需采用经过蒸馏并灭菌的去离子水

(1)缓冲液A：20mmol/LTris-HAc(pH8.0)，10mmol/LMg(Ac)₂，50mmol/L谷氨酸钾。

(2)5%(V/V)甘油，40mmoI/LNa₂EDTA(pH8.0)，40μg/mL乙酰化牛血清白蛋白，-20℃保存。

(3)缓冲液B：1.5mol/LNH₄Ac，37.5mmol/LNa₂EDTA(pH8.0)，50μg/ml无RNase的tRNA，20℃保存。

(4)缓冲液C(2X)：8mol/L尿素，0.1%(m/V)二甲苯青，0.1%(m/V)溴酚蓝。

(5)FPLC纯化的核苷酸，ATP，CTP，GTP，UTP，-80°C保存。

(6)5-SH-UTP，5-SH-CTP，5-APAS-UTP和5-APAS-CTP配制成1~3mol/L的水溶液，-80℃避光保存。

(7)T7噬菌体RNA聚合酶或大肠杆菌RNA聚合酶。

(8)[α-³²P]GTP的工作浓度范围为10⁵cpm/pmol~10⁷cpm/pmol。

(9)1mol/LNH₄Ac以无水乙醇配制，室温保存。

(10)肝素：0.5mg/ml水溶液，-20°C保存。

(11)缓冲液F：40mmol/LTris-HCl(pH7.6)，15mmol/LMgCl₂，10mmol/Lβ-巯基乙醇，乙酰化牛血淸白蛋白。

(12)酚：氯仿：异戊醇（25：24：1)。

(13)80%(V/V)乙醇。

(14)RQ1无RNase的DNaseI(Promega公司）。

(15)紫外光源号：SpectrolinemodelXX-15B，Spectroline公司）。

(16)1ml离心管。

2.分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的RNA合成

(1)100mmol/L叠氮苯酰溴（Azidophenacylbromide，APB，Sigma公司）溶于硫酸二甲酯。

(2)SephadexG-50，DNA级。

(3)缓冲液D：30mmol/LTris-HCl(pH7.0)，10mmol/LKCl，0.5mmol/LNa₂EDTA(pH8.0)。

3.RNA与蛋白的交联

(1)缓冲液C（2X）：8mol/L尿素，0.1%（m/V）二甲苯青，0.1%（m/V）溴酚蓝。

(2)10XTBE缓冲液：0.89moI/LTris碱，0.89mol/L硼酸，20mmol/LEDTA，室温保存。

(3)X射线片。

(4)增感屏。

(5)RNaseT1消化缓冲液：25mmol/L柠檬酸钠，1mmol/LNa₂EDTA(pH8.0)，-20°C保存。

(6)RNaseT1。

(7)2X蛋白上样缓冲液：60mmol/LTris-HCl（pH8.0)，60mmol/LDTT，3.4%(m/V)SDS，17%(V/V)甘油，0.02%(m/V)溴酚蓝；DTT临用前加。

(8)SDS变性聚丙烯酰胺凝胶。

(9)转移缓冲液：25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，20%(V/V)甲醇，4℃保存。

(10)硝酸纤维素膜。

(11）电转移装。

(12)银染试剂：2%(m/V)柠檬酸钠，0.8%(m/V)硫酸亚铁，0.1%(m/V)硝酸银，4℃保存。

二、操作方法

1.全长含核苷酸类似物的RNA合成

(1)100μl反应体系中加入终浓度为100nmoI/L模板DNA，100nmol/L大肠杆菌RNA聚合酶及缓冲液A(或T7噬菌体聚合酶及缓冲液F)，于37℃孵育5min。

(2)避光加入100μmol/LATP，10μmol/LUTP或CTP，20μmol/L[α-³²P]GTP，150μmol/L5-APAS-UTP或5-APAS-CTP，以及加入浓度逐渐递增的UTP或CTP(0μmol/L，1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L孵育5min。

(3)加1μl肝素，于37℃孵育10min。

(4)加入RQ1无RNase的DNaseI(5U)，于37℃孵育10min。

(5)加入100mmol/LMgCl₂，20μg无RNase的tRNA。

(6)加入等体积(100μl)酚：氯仿：异戊醇（25:24:1)，振荡混匀，14000g离心5min。

(7)取上层水相至一新离心管，加入3倍体积（300μl)的含1mol/LNH₄Ac的乙醇，混匀，冰浴10min，14000g离心5min。

(8)小心去除上清，以100μl80%(V/V)乙醇洗RNA，14000g离心5min。

(9)小心去除上清，晾干。

(10)将RNA溶于100μl去离子水或缓冲液中。

(11)将反应产物等分，取一半加入一干净离心管，将管置于UV(302nmmax)光源1.5cm处，室温照射2mm，另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处。

(12)加100mmol/LDTT以还原残余叠氮化合物，避光反应至少5min（以后操作不必再避光）。

(13)加入等体积2X缓冲液C；于95°C孵育2min；冰浴冷却；7mol/L尿素/聚內烯酰胺胶电泳（胶浓度及长度取决于待检测RNA的大小，RNA大小与胶浓度有以下对应关系：大于100nt，6%；30~100nt，5%；小于30nt，25%)。

(14)在压片盒内依次铺上滤纸，胶，保鲜膜，X线片，增感屏；-80℃放射自显影过夜。

(15)从放射自显影结果分析最适UTP或CTP浓度。

(16)按方法“RNA与蛋白交联”进行RNA蛋白质交联。

2.分子表面掺入具光交联活性的核苷酸类似物的RNA合成

(1)按方法“全长含核苷酸类似物的RNA合成”中的步骤（1）~（10）制备并纯化插入5-SH-UTP或5-SH-CTP的RNA，调pH7.0。

(2)避光环境加入APB（溶解于二甲基砜），终浓度5mmol/L。

(3)室温避光孵育2h。

(4)制备SephadexG-50柱：称取7gScphadexG-50，加100ml去离子水，悬浮液高压灭菌。将1ml的SephadexG-50悬浮液加入1ml的柱内，3500g离心3min，重复上样至柱内凝胶体积达750μl。

(5)以200μl缓冲液D平衡柱，3500g离心4min，重复3次，弃洗脱液。

(6)避光加入200μl反应液[凝胶与样本液之间的比例(750：200)十分关键]。

(7)3000g离心3min。

(8)收集流出液，按方法“RNA与蛋白交联”进行RNA-蛋白质交联。

3.RNA与蛋白交联

(1)在RNA-蛋白质交联中采用前面实验优化得到的最佳UTP和CTP浓度，重复方法1中的步骤(1)~(9)，用灭菌的去离子水或适宜的缓冲液(根据相应的RNA或蛋白决定）重悬RNA，加入适宜浓度的可能与RNA结合的蛋白。

(2)将反应产物等分，取一半加入一干净离心管，将管置于UV光源1.5cm处，室温(有些结合需要特定的反应温度）照射2min，另一半反应产物在照射过程中置于室温避光处作为阴性对照。

(3)加入DTT至终浓度100mmol/L，避光放置至少5min（此后步骤不必再避光）。

(4)从未受照射的样本中取出少量样品用于鉴定所用RNA长度的正确性。[见方法“全长含核苷酸类似物的RNA合成”中，步骤(13)]。

(5)余下样品加入等体积的RNaseT1消化缓冲液及10U/μlRNaseT1，于37°C孵育10min。

(6)加入等体积的2X蛋白上样缓冲液，94°C加热2~3min，变性SDS-PAGE电泳。

(7)常规“三文治”法电转移：500mA，2h。

(8)取膜银染至见到条带（约5min），空气下燥。

(9)X射线片，-80°C放射自显影至交联蛋白显现(对交联效率低的蛋白可能需要数天）。