【专题讨论】关于不同类型的缓冲剂和去垢剂的使用区别

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2021-07-23

问题描述：

实验中我们会使用到不同的缓冲系统以及一些去垢剂，
如常用于缓冲的Tris、HEPES、MPOS等等，去垢剂如NP40,Tween-20，TritonX100,CHAPS，脱氧胆酸钠，SDS等等，
大家能说说这些试剂的使用区别吗（最好讲讲某些情况下使用一些会优于另一些的例子）
有时候某些裂解液含10%左右甘油，又是为何？

平时我们用习惯了一些配方，可能有时候不太清楚为何有些是可替代的，有些是不可替代的，借此机会想听听大家的见解？

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skykiller

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个人觉得降龙战友的这个提议很好，但是似乎要参与讨论又难以说出个所以然。可能我们平常在使用缓冲液或表面活性剂方面只是按照手册或文献上的配方copy，没有多深究其中的道理。查了少许资料，结合本人在蛋白质纯化方面的一些工作经验，谈谈吧，不对之处，请大家狠劲拍。也希望从事其它领域的战友们来谈谈看法，如组织蛋白抽提、膜蛋白提取、核蛋白提取等等。一、缓冲液Hepes、Mops等我基本不用。在蛋白纯化时用的最多的缓冲体系有下列几种：1、PB（磷酸钠盐缓冲液）个人在pH5.5-8.5的范围内都用过。基本上觉得没有什么限制的地方。电导值稍高，使用浓度大约为5-20mM。冰箱保存时易结晶析出，这一点有些烦人。特别是0.2M的母液。2、Tris-HCl我常用的pH范围为pH7.5-9.5。对有些系统的应用有限制，主要是有些怕氨基影响的试验。如利用蛋白质氨基进行反应的接抗原或抗体亲和柱，接酶HRP，Ni柱的某些时候很弱的吸附等。相同浓度下电导值小于PB。如果想在低电导下进行离子交换柱的吸附纯化，可能选用Tris更容易控制电导。缓冲能力较强。水溶性好，低温不易析出。可配制2M浓度的母液储存，使用很方便。、3、CB（碳酸钠缓冲液）常用的pH范围为pH8.0-10.0。不能应用Tris时的替代缓冲。二、表面活性剂1、SDS很强的阴离子性表面活性剂。做电泳用，在纯化过程中基本不能用。SDS使得蛋白链的电荷效应屏蔽，只有SDS的负电荷覆盖在表面。而且SDS一旦加入，基本就不可能去除干净了。曾经为了找到去除蛋白质溶液中SDS的方法，查阅了大量的资料，专利也好，文章也好，结果是不可能。即使有那么一两种方法提到了，但是按其操作明显蛋白的性质会大大改变。2、Triton x100这是蛋白纯化过程中常用的一种非离子型表面活性剂。常常用在包涵体洗涤和包涵体溶解的缓冲体系中。由于是非离子型的，对离子交换层析基本没有什么影响。3、Tween-20也是非离子型的。对于我就通常就用Triton代替了。三、其它1、甘油极好的水溶性。在蛋白质纯化和复性时常用。甘油有助于蛋白质的溶解，减少复性时蛋白质沉淀的可能。使用浓度我是5-20%。在蛋白质保存时，可以通过加入甘油避免多次的冻融。一般可加30-50%。另外，在对SDS-PAGE胶进行干燥保存时，加一点点甘油可以防止胶开裂。甘油对Ni柱，离子交换柱，亲和层析柱，分子筛等都没有明显的影响。加入后，由于溶液的粘度增大，操作压力也会增大，要减小一些流速。2、EDTA螯合剂，常用其钠盐，否则很难溶解。作用我们一般就认为是鳌合体系中微量的金属离子，抑制可能的蛋白酶作用。EDTA与Ni柱纯化不兼容，注意。EDTA在蛋白质复性时也可以加入，有时候有很好的效果。小分子，去除方便。

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dingchen

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好东西，先收藏！

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涛声依旧神游天下

用户

怎么沉帖了啊，顶起来啊

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