| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | 待标记的培养细胞 试剂、试剂盒 | 37℃标记培养液1Ci／mlH3(32)PO4(溶于HCl)冰冷Tris平衡盐水(TBS)／磷酸盐平衡盐水(PBS)温和裂解缓冲液／RIPA裂解缓冲液 仪器、耗材 | 树脂玻璃挡板(1in厚)取液器吸头树脂玻璃盒37℃微量离心管一次性吸管橡皮细胞刮子Sorvall冷冻离心机(或其他)树脂玻璃薄板／4℃树脂玻璃管架 实验步骤 | 实验试剂仪器的具体要求见「其他」。 1.培养待标记的细胞至适当的生长期。 生长旺盛的细胞中磷酸盐转运达到最高峰，除非研究静止期细胞的蛋白质磷酸化，一般待标记的细胞生长密度不要达到汇片，标记前3～18h换新鲜的培养液培养将有利于标记。 2.吸去培养液，用37℃的含血清不加标记物的标记培养液洗尽残存的含磷酸盐的培养液，吸尽该培养液。 3.加入预热的标记培养液，加入量为：（0.5～1ml）/35mm培养皿，（1～2ml）/50mm培养皿，或（2～4ml）/100mm培养皿。 4.在树脂玻璃挡板后操作，使用配备塞有棉花防浮质吸管的微量移液器加入32P至终浓度为0.1～2mCi/ml。 标记1～2h已足够，但细胞可在6h内耐受高达2mCi/ml和在18h内耐受低浓度（0.1～0.5mCi/ml）的辐射。 6.标记结束时，将装有标记细胞的树脂玻璃盒移至冷室，放在树脂玻璃挡板后面。 7.从树脂玻璃盒子中取出培养皿，用一次性的移液管吸尽标记培养液，培养液和吸头或吸管均作为同位素废物弃置。 8.用2～10ml冷TBS洗涤细胞2次，同步骤7一样吸尽并弃去放射性废物。 9.加适量裂解缓冲液（0.3ml/35mm培养皿，0.6ml/50mm培养皿或1.0ml/100mm培养皿），用橡皮细胞刮子擦刮下贴壁细胞，裂解物留在培养皿上，4℃放置20min。用橡皮细胞刮子将贴壁细胞的裂解液移至培养皿边缘，并将裂解液移入带螺口盖的微量离心管中。 10.盖上管盖，于4℃26000g离心30min澄清裂解液。 11.离心后，将上清（裂解物）移至新离心管中，离心管和沉淀作为同位素污物处理。 12.用凝胶电泳、免疫沉淀或蛋白质纯化方法，分析标记的裂解液，所有过程均在4℃适当屏蔽下进行。 注意事项 | 1.除非特别说明，细胞培养在加湿的37℃，10%CO2培养箱中进行。 2.步骤7中，不能用真空泵吸标记培养液。真空泵抽吸会产生放射性气溶胶并在仪器中留下放射性薄层。继续Plexiglas挡板后处理细胞和裂解。 3.步骤9中，如果需要降低由非特异性杂质造成非特异性的背景，可使用RIPA裂解缓冲液。如果要求保持酶的活性或蛋白质复合物的结构，使用含CHAPS（3-胆酰胺丙基-二乙胺丙磺酚）或NonidetP-40（乙基苯基聚二乙醇，即NP-40）作为唯一去污剂的温和裂解缓冲液。要完全溶解细胞和使蛋白质变性，使用SDS裂解方法。 4.步骤10中管内液体最好是装至半满以防液体溅出。 用RIPA缓冲液制备裂解液时，由于细胞核的溶解常导致细胞裂解液变得黏稠。当发生这种情况时，延长离心时间到90min，或离心前在RIPA液中加入50μl固相化金黄色葡萄球菌，都可使DNA沉于管底。 其他 | |
