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双向电泳前去垢剂和离液剂对蛋白质的增溶作用

来自 : mayitao

1.前言

以双向电泳为基础的蛋白质组学研究中，蛋白质的溶解是一项艰巨的任务。举例来说，蛋白质必须达到它们的pI，并且在这个pI保持可溶性，pI也是溶解度的最低限度。此外，当蛋白质接近它们的pI值时，蛋白质的流动性下降，在强烈的电场中(200V/cm，与用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳10~20V/cm相比并不罕见）蛋白质进行等电聚焦（IEF)。反过来意味，一般的盐类和离子化合物在IEF中几乎被排除。此外，在IEF之前使用的任何溶剂，不得改变蛋白质原有的pI。因此，这排除了使用强离子去垢剂如SDS。然而，少量的[0.03%(m/V)以内]离子去垢剂还是可以用，提供SDS与其他非离子去垢剂相互交换的条件，这确保去除了与蛋白质紧密结合的SDS，但在等电聚焦过程中SDS的用处也损失了。因此，建议在IEF之前蛋白样品彻底溶解之后作用SDS。

抛开这些由于蛋白质自身性质而产生的问题不说，许多生物样品中存在的问题源于样品中存在的非蛋白类化合物。典型的例子是，核酸浓度过高时完全模糊了双向电泳图谱[4]。核酸在低离子强度的IEF中起着移动离子交换的作用从而造成假象。其他类别的化合物（脂类，盐等）也会在蛋白样品电泳图谱中产生假象。尤其是植物样品，因为植物组织能合成一系列具有不同结构的化合物。举例来说，在一些植物组织中酚类物质和叶绿素是非常丰富的，在蛋白质组学技术中有时能完全破坏蛋白质的分离提取。

因此根据初始材料的不同存在不同的问题。当从整个组织开始时，普遍面临的主要问题是非蛋白化合物所产生的干扰。这些方面将在本书的其他章节描述。本章将侧重于其他方面的问题，如镶嵌蛋白的溶解，和主要解决用于蛋白质初步溶解和IEF的离液剂和去垢剂。

如前所述，IEF中的制约因素限制了化学药品的选择，在pH波动范围内样品溶液不能有净电荷产生，如非离子型或两性离子化合物。这限制了酰胺和尿素类离液剂的选择，胍和脒在pH12以下是带电荷的。尿素作为可行的离液剂已经使用了很长一段时间了。最近，加入硫脲的尿素离液剂不仅增加蛋白溶解性[5]但而且还限制蛋白酶活性[6]。在溶解过程中离液剂的作用是打破样品中的各种分子非共价的相互作用（如氢键，偶极-偶极的相互作用，以及疏水相互作用）并且使蛋白质展开。虽然离子键不受非离子型离液剂如尿素和硫脲直接影响，这些离液剂对水的电容率的影响也改变离子键的强度。

去垢剂方面，不带电荷的去垢剂的效率比离子的显然少得多，这是很清楚的。离子去垢剂，使蛋白质分子穿了一件带电「外套」，从而使蛋白质-去垢剂复合物通过离子相互排斥，从而防止蛋白的聚集。然而离子去垢剂不能用于IEF的二向分离。不过，它们可以用在分区电泳方法中，本章将会给出一个简短的例子。

广泛的商业非带电去垢剂的选择中，共有两个亚类。非离子型去垢剂分子不带电荷，而两性离子去垢剂分子上有同等数量的正负电荷。根据分子的可电离基团pK，一些去垢剂可以在一定的pH范围内离子化（其中至少有一个基团被滴定）在另一pH范围内两性离子化，而其他去垢剂则在完整的pH范围才被两性离子化。举一个说明两种情况的例子，当羧酸基团没有充分去质子化，甜菜碱（带有四铵盐和羧酸基团）在低pH下会带上正电荷；当羧酸基团完全被去质子化后，如超过PK 2pH单位以上，它们即成为一个两性离子去垢剂。相比之下，磺基甜菜碱，带有四铵盐和磺酸基团，在0~14的pH范围是两性离子，因为两个基团在这个范围内都电离。事实上，去垢剂只有在pH范围内完全电离为两性离子才可用于IEF。

两种传统用于双向电泳的去垢剂是非离子型去垢剂TritonX-100(或NP-40)和两性离子去垢剂3 [3-cholaminoproply diethylammonio] -1-propane sulfate (CHAPS)。两种去垢剂都已尿素结合广泛使用，但没有被证明在溶解难溶性蛋白质（如膜蛋白）方面非常有效[7]。然而，最近的工作表明，无论是特别设计的两性离子去垢剂[8~10]，或精心选择的非离子型去垢剂[11]都可以溶解膜蛋白。有趣的是，TritonX-100只与尿素合用不如与尿素-硫脲合用更有效[11]。这个发现已延伸到其他低聚乙二醇去垢剂家族，如Brij去垢剂，如线性烷基寡聚乙二醇化合物[11]。然而，最有效的非离子型去垢剂属于糖苷家族（如辛基葡萄糖苷、十二烷基麦芽糖苷），而后者在单独与尿素使用[12]和与尿素-硫脲使用[11，13]同样有效。由于不同去垢剂的选择而引起蛋白质溶解多样化的例子见图12-1。溶解过程中发挥作用的多种变量在参考文献14中也有研究。尽管如此，我们并不能因为前文讨论就认为十二烷基麦芽糖苷就是双向电泳中蛋白溶解的最好的去垢剂。虽然去垢剂的选择取决于蛋白样品自身的特性，但是根据之前的实验结果，还是有些可作为常用去垢剂用于蛋白质溶解，例如十二烷基麦芽糖苷、ASB14、C7B20、Br-ij56和C13E10，对于可溶性蛋白，CHAPS是很好的选择。