免疫球蛋白标记技术_荧光素标记抗体技术
实验方法原理 | 目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocynate,FITC)或罗达明(LissaminerhodamineB200,RB200)。在碱性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。 | ||||||||
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实验材料 | 抗体 试剂、试剂盒 | FITCPBSDMSO碳酸盐缓冲液 仪器、耗材 | 搅拌器紫外分光光度计 实验步骤 | 1. 将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜,透析后抗体液移入小烧杯中 2. 称取适量IFTC,加入二甲亚砜(DMSO)(FITC~1mg/1mlDMSO),使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO FITC/IgG比例 如IgG浓度为1mg/ml,FITC/IgG比例约为50μgFITC/mgIgG; 如IgG为5~10mg/ml,则比例为25μgFITC/mlIgG 在10ml小烧杯中先放入抗体 3. 按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中 4. 将标记物用PBS加至2.5ml,磁力搅拌器室温下避光搅拌2h,用PD10柱(SephadexG25柱)除去游离荧光素,先用25mlPBS淋洗G25柱。收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定F/P比值。第二个荧光素峰为游离荧光素。 计算: 2.87×A495 F/P=──────── A280-0.35×A495 合适的F/P值为2~4。 注意事项 | 1. FITC保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解。 2. FITC-DMSO液要临用时配制。 3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制。 |
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发布于 : 2021-07-21
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