单克隆抗体的腹水制备实验一基本方案
| 实验材料 | 杂交瘤细胞 试剂、试剂盒 | 完全DMEM-10HEPES丙酮酸钠PBS 仪器、耗材 | 注射针头离心管转子离心机 实验步骤 | 1. 用20G或22G的注射针，小鼠腹膜内注射降植烷，每只鼠0.5~1ml，1周后接种细胞。 2. 在175cm2培养瓶中加完全DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。 3. 将培养液转入50ml锥形离心管中，室温下500g离心5min。 4. 细胞重悬于50ml无菌的PBS或HBSS（不含FBS）中洗涤。然后室温下500g离心5min，弃上清。重复2次，然后细胞重悬于5ml的PBS或HBSS中。 5. 计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细胞活力。 6. 用不含FBS的HBSS或PBS调整细胞浓度至2.5×102细胞/ml。 7. 用一个10ml的无菌的带22G针头的注射器，对裸鼠进行腹膜内注射2ml细胞，等待腹水形成（1~2周）。 8. 收获腹水。 （1）一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。 （2）另一只手将一只18G的计头插入小鼠腹腔1~2cm深。 （3）进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中线处的主要大血管。 （4）令腹水滴入一只无菌的15ml聚丙烯锥形离心管中。 9. 于室温下，1500g离心腹水10min，收集上清，弃沉淀，将腹水存放于4℃，直到收集腹水的工作完成（在1周内）。 10. 再次收获腹水前，让小鼠再次积累腹水（2~3天），具体操作同步骤8，腹水的加工处理操作同步骤9。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。此时，可处死小鼠 11. 把在几天内收集到的腹水汇集到一起，于56℃水浴45min进行热处理，如果凝块形成，可参照步骤9中方法去除之，然后再离心。 12. 采用适当的方法检测腹水中的MAb的滴度。 13. 按大于1：10的比例稀释MAb，并进行滤过除菌，滤膜孔径为0.45μm，分装并冻存于-70℃，避免反复冻融，可冻存数年之久。 |
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发布于 ： 2021-08-18
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