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干细胞的鉴定实验一透射电镜样品制备技术

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实验步骤	透射电镜样品制备技术为了满足透射电镜观察的要求，超薄切片必须做到以下几点：①切片能够耐受电子束的照射，在热和高真空条件下有一定的稳定性。②细胞的超微结构保存良好，尽量减少人工假象。③切片厚度一般在60〜80nm为宜。切片太薄可得到较高的分辨率，但反差弱；切片太厚，又会出现结构重叠，分辨率低，甚至会出现电子束不能穿透切片以致无法观察的现象。④要求切片无皱褶、无刀痕、无颤痕和无染色剂污染，并具它将成为细胞结构的支架，并能承受切片时的各种力的作用。包埋剂：环氧树脂包埋剂常温下为单体，属于甘油多聚酯类，分子中含环氧基和羟基两种反应基团，环氧基与胺类(加速剂)反应，形成首尾相接的长链状聚合物，而硬化剂(固化剂)的酸酐则与羟基结合形成分子间的横桥连接◦环氧树脂单体、胺类和酸酐等按一定比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的稳定交联状聚合物。常用包埋剂的配制：环氧树脂Epon812是一种淡黄色、低黏度，使用最广泛的环氧树脂，它易渗入组织，利于细胞结构的保存。它与硬化剂DDSA(十二烷基琥珀酸酐)、MNA(甲基内次甲基邻苯二甲酸酐)和加速剂DMP-30[2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酔]按一定的比例配制而成，见表2.4。 (3)包埋和聚合方法：将胶囊注满包埋液，用牙签移动样品到胶囊的中心，使组织自然沉落到胶囊的底部。如做定向包埋(如皮肤、消化道、呼吸道等组织)，取材时应将组织切成长方形，包埋时将所要切片的一端对准包埋模具的尖部进行包埋。包埋后样品放入聚合器内，聚合温度及时间为：35℃，12h;45℃，12h;60℃，24h。半薄切片为了在电镜下最后确定感兴趣的组织的位置，』获得在光镜下检查的半薄组织切片是很有必要的。修块将包埋块修成与顶面呈45。斜面的锥体形。顶端是切片面，修成梯形、正方形或长方形。切半薄切片用超薄切片机切下的切片，滴一滴蒸馏水在涂有血清的载物片上，将切片浮在蒸馏水滴上，在70——80℃电热板上烤干后，再进行苏木素-伊红(HE)染色。超薄切片载网及支持膜 (1)载网：超薄切片需放置到铜、镍、金等材料制成的载网上，经染色后才能在电镜下观察。载网的直径为3mm，孔数有50、100、200和400目。最常用的是200目载网。 (2)支持膜：在载网上铺覆一层薄膜是为了增加切片对电子轰击的耐受强度。支持膜的制备方法：支持膜是用0.4%火棉胶-醋酸戊脂溶液或0.1%〜0.2%聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)氯仿溶液制备而成。先将干净载玻片浸人上述液体中，提出载玻片并使之直立于滤纸上，待干后即在载玻片上形成一层薄膜。用小刀或镊子尖划断膜的四边，将载玻片插入双蒸水中，使薄膜与载玻片剥离而漂浮于水面上。再将洗干净的铜网凸面贴膜，排列于膜上。最后用干净载玻片捞起支持膜及铜网，干燥备用。超薄切片 (1)超薄切片机：现市场上有国产及进口的不同牌号的切片机，就其推进原理可分为热膨胀式和机械式两种类型。不同型号的超薄切片机操作方法不同，使用者应按仪器操作手册进行操作。 (2)切片刀：切片刀分有玻璃刀和钻石刀两种。大多数是使用一次性的玻璃刀。钻石刀价格昂贵，适合用于硬度高的样品。 (3)超薄切片厚度：60——70nm。 (4)捞片：用眉毛针把切片集中，然后用铂金丝圈将它捞出，放置于载网中央。超薄切片的染色指染色剂(一般为重金属盐)与细胞的某些成分结合或吸附，从而增加其散射电子的能力。不同部位对重金属盐离子的吸附能力不同，吸附重金属能力强的区域，散射电子的能力就强，表现为暗区，反之为亮区。醋酸双氧铀-柠椽酸铅染色法 (1)醋酸铀：又称醋酸双氧铀。能与细胞内大多数成分结合，主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差，也能对糖原、分泌颗粒和溶酶体染色，但对膜结构染色效果差。醋酸铀染液：使用棕色试剂瓶配制染液，醋酸双氧铀2g加50%乙醇IOOml，充分搅拌lOmin，静置1〜2天后取其上清液或过滤后取其过滤液。醋酸铀具有一定的放射性及化学毒性，遇光易分解，应密封避光冷保存。 (2)柠檬酸铅：铅的电子密度很高，对细胞的微细结构有广泛的亲和力，能提高细胞膜系统、脂类和糖原颗粒的反差。柠檬酸铅具有一定的毒性。柠檬酸铅染色液：硝酸铅Pb(NO3)2l.33g 柠檬酸钠Na(C6H5O2).H2O1.76g 双蒸水30ml 将上述成分放入50ml容量瓶中，用力振荡30min，至溶液呈乳白色混浊状后，加入lmol/LNaOH8ml，使溶液变为清亮透明，再加双蒸水至50ml，染液pim.O,置4℃冰箱保存。 2)娃胶板染色法硅胶板染色器具：小玻璃试管2支，同时每根试管各配一个橡皮塞子；硅橡胶板1块：用双面刀片在板上划两排共36条划缝(图2.1)。染色方法： (1)左手持桂橡胶板，用中指从板背面轻轻顶起，使板上的划缝张开，右手用镊子将铜网插入划缝内，直到插完最后一张切片。 (2)将硅橡胶板插入试管内，加入铀染色液，盖好橡皮塞子，染色15——20min。 (3)用镊子将硅橡胶板从试管内取出，用蒸馏水冲洗20min，再用滤纸将水吸干。 4)用同样的方法将硅橡胶板插入到另一根试管内，加入铅染液，盖好橡皮塞子,染色5——7min，取出板用蒸馏水冲洗20min，用滤纸将水吸干，自然干燥后即可电镜观察。注意：①铅染液最好使用99.99%的高纯度的硝酸铅配制，因为其染色效果好并且不易污染切片。②由于醋酸铀和柠檬酸铅染液具有放射性和毒性，因此操作时要注意防护。特殊样品的制备 1)血细胞、骨髓细胞抽静脉血(抽骨髓)3——4ml，放入含有肝素抗凝剂的离心管内摇勻，以800——1000r/min的速度离心8〜lOmin，血液可分为血浆(上层)、白细胞(白色中层)和红细胞(红色下层)三层。用吸管沿管壁轻轻地将血浆吸掉，露出白细胞层，沿壁缓慢加人2.5%的戊二酵，4℃固定lh。取出透明层，切成lmmxlmmx2mm长方块，再用戊二醛固定1h。其他步骤按常规样品制备。 2)培养细胞样品由于培养细胞小、数量少以及培养方式的多样化，使得完全按照同一个方法制备样品已不能满足培养细胞电镜观察的要求。应根据观察目的选择合适的细胞培养方式，再采用不同的制样方法。 (1)根据观察目的的不同，归纳了4种不同的细胞培养方式：①观察细胞一般形态的超微结构，细胞应在培养瓶(玻璃或塑料)或培养皿(玻璃或塑料)内培养，细胞呈贴壁式或悬浮式生长；②观察细胞和细胞间的连接结构，细胞应在载玻片、可拆卸的96孔培养板中或滤膜(Millipore0.45pmpore)上培养；③观察原位特定细胞(如观察某个培养细胞的分裂像)，细胞应在35mm塑料培养皿中或6孔培养板内培养；④观察组织工程中培养在胶原内的新生细胞。 (2)根据不同的细胞培养方式，选择不同的样品制备方法。 a.培养瓶内细胞的样品制备方法：游离的培养细胞以800〜100〇r/min的转速离心IOmin，细胞沉在离心管底部，1.5h。其他步骤按常规制样方法进行。贴壁细胞：用硅胶刮将细胞刮下来，切忌使用刀片刮，离心后按上述方法制备。 b.原位包埋法：①细胞长在载玻片上：将细胞连同载玻片一起固定、脱水和浸透。细胞面朝上与液体直接接触。在光镜下先选好要观察的细胞区域然后再包埋。②细胞在可拆卸的用吸管吸去培养液，加人戊二醛固定液4^固定96孔板内培养：样品制备在板内进行，固定、脱水、浸透和包埋均按上述方法操作，聚合后用锤子砸碎塑料外壳，取出样品块，修块后可直接切片。③原位特定细胞培养在35mm塑料培养皿或6孔板中：同②制备方法一样，在培养皿内进行固定、脱水、浸透、包埋和聚合，在光镜下定位观察细胞，经修块后再切超薄切片。④细胞长在滤膜或胶原上：将滤膜或胶原视为一个组织块，按上述制备方法进行固定、脱水和浸透，最后用定向平板包埋板包埋(图2.2)

实验步骤

透射电镜样品制备技术

为了满足透射电镜观察的要求，超薄切片必须做到以下几点：①切片能够耐受电子束的照射，在热和高真空条件下有一定的稳定性。②细胞的超微结构保存良好，尽量减少人工假象。③切片厚度一般在60〜80nm为宜。切片太薄可得到较高的分辨率，但反差弱；切片太厚，又会出现结构重叠，分辨率低，甚至会出现电子束不能穿透切片以致无法观察的现象。④要求切片无皱褶、无刀痕、无颤痕和无染色剂污染，并具

它将成为细胞结构的支架，并能承受切片时的各种力的作用。

包埋剂：环氧树脂包埋剂常温下为单体，属于甘油多聚酯类，分子中含环氧基和羟基两种反应基团，环氧基与胺类(加速剂)反应，形成首尾相接的长链状聚合物，而硬化剂(固化剂)的酸酐则与羟基结合形成分子间的横桥连接◦环氧树脂单体、胺类和酸酐等按一定比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的稳定交联状聚合物。常用包埋剂的配制：环氧树脂Epon812是一种淡黄色、低黏度，使用最广泛的环氧树脂，它易渗入组织，利于细胞结构的保存。它与硬化剂DDSA(十二烷基琥珀酸酐)、MNA(甲基内次甲基邻苯二甲酸酐)和加速剂DMP-30[2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酔]按一定的比例配制而成，见表2.4。
表 2.4 Epon 8 1 2 包埋剂配方表

(3)包埋和聚合方法：将胶囊注满包埋液，用牙签移动样品到胶囊的中心，使组织自然沉落到胶囊的底部。如做定向包埋(如皮肤、消化道、呼吸道等组织)，取材时应将组织切成长方形，包埋时将所要切片的一端对准包埋模具的尖部进行包埋。包埋后样品放入聚合器内，聚合温度及时间为：35℃，12h;45℃，12h;60℃，24h。

半薄切片

为了在电镜下最后确定感兴趣的组织的位置，』获得在光镜下检查的半薄组织切片是很有必要的。

修块

将包埋块修成与顶面呈45。斜面的锥体形。顶端是切片面，修成梯形、正方形或长方形。

切半薄切片

用超薄切片机切下的切片，滴一滴蒸馏水在涂有血清的载物片上，将切片浮在蒸馏水滴上，在70——80℃电热板上烤干后，再进行苏木素-伊红(HE)染色。

超薄切片

载网及支持膜

(1)载网：超薄切片需放置到铜、镍、金等材料制成的载网上，经染色后才能在电镜下观察。载网的直径为3mm，孔数有50、100、200和400目。最常用的是200目载网。

(2)支持膜：在载网上铺覆一层薄膜是为了增加切片对电子轰击的耐受强度。

支持膜的制备方法：支持膜是用0.4%火棉胶-醋酸戊脂溶液或0.1%〜0.2%聚乙烯醇缩甲醛膜(formvar膜)氯仿溶液制备而成。先将干净载玻片浸人上述液体中，提出载玻片并使之直立于滤纸上，待干后即在载玻片上形成一层薄膜。用小刀或镊子尖划断膜的四边，将载玻片插入双蒸水中，使薄膜与载玻片剥离而漂浮于水面上。再将洗干净的铜网凸面贴膜，排列于膜上。最后用干净载玻片捞起支持膜及铜网，干燥备用。

超薄切片

(1)超薄切片机：现市场上有国产及进口的不同牌号的切片机，就其推进原理可分为热膨胀式和机械式两种类型。不同型号的超薄切片机操作方法不同，使用者应按仪器操作手册进行操作。

(2)切片刀：切片刀分有玻璃刀和钻石刀两种。大多数是使用一次性的玻璃刀。钻石刀价格昂贵，适合用于硬度高的样品。

(3)超薄切片厚度：60——70nm。

(4)捞片：用眉毛针把切片集中，然后用铂金丝圈将它捞出，放置于载网中央。

超薄切片的染色

指染色剂(一般为重金属盐)与细胞的某些成分结合或吸附，从而增加其散射电子的能力。不同部位对重金属盐离子的吸附能力不同，吸附重金属能力强的区域，散射电子的能力就强，表现为暗区，反之为亮区。

醋酸双氧铀-柠椽酸铅染色法

(1)醋酸铀：又称醋酸双氧铀。能与细胞内大多数成分结合，主要是提高核酸、核蛋白和结缔组织纤维成分的反差，也能对糖原、分泌颗粒和溶酶体染色，但对膜结构染色效果差。

醋酸铀染液：使用棕色试剂瓶配制染液，醋酸双氧铀2g加50%乙醇IOOml，充分搅拌lOmin，静置1〜2天后取其上清液或过滤后取其过滤液。醋酸铀具有一定的放射性及化学毒性，遇光易分解，应密封避光冷保存。

(2)柠檬酸铅：铅的电子密度很高，对细胞的微细结构有广泛的亲和力，能提高细胞膜系统、脂类和糖原颗粒的反差。柠檬酸铅具有一定的毒性。

柠檬酸铅染色液：
硝酸铅Pb(NO3)2l.33g
柠檬酸钠Na(C6H5O2).H2O1.76g
双蒸水30ml

将上述成分放入50ml容量瓶中，用力振荡30min，至溶液呈乳白色混浊状后，加入lmol/LNaOH8ml，使溶液变为清亮透明，再加双蒸水至50ml，染液pim.O,置4℃冰箱保存。

2)娃胶板染色法

硅胶板染色器具：小玻璃试管2支，同时每根试管各配一个橡皮塞子；硅橡胶板1块：用双面刀片在板上划两排共36条划缝(图2.1)。图 2 . 1 硅胶板染色器具

染色方法：
(1)左手持桂橡胶板，用中指从板背面轻轻顶起，使板上的划缝张开，右手用镊子将铜网插入划缝内，直到插完最后一张切片。

(2)将硅橡胶板插入试管内，加入铀染色液，盖好橡皮塞子，染色15——20min。

(3)用镊子将硅橡胶板从试管内取出，用蒸馏水冲洗20min，再用滤纸将水吸干。

4)用同样的方法将硅橡胶板插入到另一根试管内，加入铅染液，盖好橡皮塞子,染色5——7min，取出板用蒸馏水冲洗20min，用滤纸将水吸干，自然干燥后即可电镜观察。

注意：①铅染液最好使用99.99%的高纯度的硝酸铅配制，因为其染色效果好并且不易污染切片。②由于醋酸铀和柠檬酸铅染液具有放射性和毒性，因此操作时要注意防护。

特殊样品的制备

1)血细胞、骨髓细胞

抽静脉血(抽骨髓)3——4ml，放入含有肝素抗凝剂的离心管内摇勻，以800——1000r/min的速度离心8〜lOmin，血液可分为血浆(上层)、白细胞(白色中层)和红细胞(红色下层)三层。用吸管沿管壁轻轻地将血浆吸掉，露出白细胞层，沿壁缓慢加人2.5%的戊二酵，4℃固定lh。取出透明层，切成lmmxlmmx2mm长方块，再用戊二醛固定1h。其他步骤按常规样品制备。

2)培养细胞样品

由于培养细胞小、数量少以及培养方式的多样化，使得完全按照同一个方法制备样品已不能满足培养细胞电镜观察的要求。应根据观察目的选择合适的细胞培养方式，再采用不同的制样方法。

(1)根据观察目的的不同，归纳了4种不同的细胞培养方式：①观察细胞一般形态的超微结构，细胞应在培养瓶(玻璃或塑料)或培养皿(玻璃或塑料)内培养，细胞呈贴壁式或悬浮式生长；②观察细胞和细胞间的连接结构，细胞应在载玻片、可拆卸的96孔培养板中或滤膜(Millipore0.45pmpore)上培养；③观察原位特定细胞(如观察某个培养细胞的
分裂像)，细胞应在35mm塑料培养皿中或6孔培养板内培养；④观察组织工程中培养在胶原内的新生细胞。

(2)根据不同的细胞培养方式，选择不同的样品制备方法。

a.培养瓶内细胞的样品制备方法：游离的培养细胞以800〜100〇r/min的转速离心IOmin，细胞沉在离心管底部，1.5h。其他步骤按常规制样方法进行。贴壁细胞：用硅胶刮将细胞刮下来，切忌使用刀片刮，离心后按上述方法制备。

b.原位包埋法：①细胞长在载玻片上：将细胞连同载玻片一起固定、脱水和浸透。细胞面朝上与液体直接接触。在光镜下先选好要观察的细胞区域然后再包埋。②细胞在可拆卸的用吸管吸去培养液，加人戊二醛固定液4^固定96孔板内培养：样品制备在板内进行，固定、脱水、浸透和包埋均按上述方法
操作，聚合后用锤子砸碎塑料外壳，取出样品块，修块后可直接切片。③原位
特定细胞培养在35mm塑料培养皿或6孔板中：同②制备方法一样，在培养皿内进行固定、脱水、浸透、包埋和聚合，在光镜下定位观察细胞，经修块后再切超薄切片。④细胞长在滤膜或胶原上：将滤膜或胶原视为一个组织块，按上述制备方法进行固定、脱水和浸透，最后用定向平板包埋板包埋(图2.2) 图 2 . 2 大鼠脊髓少突胶质细胞 (HOOx)