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实验方法原理
实验材料
仪器、耗材
实验步骤

除了人工解析碎片离子谱外,还有两种基本检索手段用于匹配数据库中序列产生的碎片离子谱。


第一种方法依靠人工解析部分谱图来鉴别某一特定系列(b或v)离子的连续离子元素(例如鉴别出相互之间相差一个氨基酸残基质量的碎片离子),解析出部分序列信息,再结合以下参数:①鉴定出的系列中第一个离子的质量数;②肽段质量与最后一个离子质量之差(这两个质量数限制了此序列两端未知残基的总质量),③此完整肽段的质量,④所用蛋白水解酶的酶切持性(在N端'C端都切还是只切一端)。这五种信息组成了肽序列标签"PST"(peptidesequencetag,PST)。在序列数据库中可以检索出符合PST各元素内容的肽序列。


第二种类型的碎片离子检索程序是真正的用未解析的碎片离子信息检索的程序,称为SEQUEST。其检索手段首先是在数据库中的每个序列中寻找与实验测量肽离子质量致的肽段(在一定误差范围以内)、肽段质量计算值是其连续氨基酸质量之和,在检索时如有必要,还要利用蛋白酶的酶切位点特异信息。对检索到的每一个候选队,程序计算出其在相同CID实验条件下预期产牛的碎片离子质量数。然后用簇分析算法(cluster-analysisalgorithms)将前500个计算值与实验测得的碎片离子谱比较。每一个比较结果都有一个得分值,报告出得分最高的结果,如果得分值有显著性意义则蛋白质鉴定成功。此方法的鉴定基础是未经任何解析的肽段碎片离子质谱图。在数据依赖LC-MS/MS分析中可以自动化地应用这一技术。分析过程中,肽段经反相HPL(分商,电喷雾进入联机质谱仪,此质谱仪可进行数据依赖的MS/MS分析,即将离子流超过一定阈值的所有离子打碎进行MS/MS分析,并记录所打的谱,自动提交检索。这种自动化手段有许多优点:


(1)复杂的蛋白质混合物可以被逐个鉴定,因为每一个做MS/MS分析的肽段产生的碎片离子数据都独立进人数据库检索.,


(2)在这种类型的分析中,来自于每一个肽段的碎片离子谱都代表一个独立的数据库检索。如果一个单一的蛋白质被酶解蛋白质鉴定结论基本上能够自动确定,因为在多肽段检索结果中,应该是同一个蛋白位于般高排位,


(3)如上所述,这一方法的自动化程度高。


(4)通过指导程序可以预测某一特定残基上的特定修饰,此方法适用于寻找行特定翻译后修饰的肽段,同样可以以鉴定产生这一翻译后修饰肽段的蛋白质

注意事项
其他