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哺乳动物细胞基因稳定转染的实验一基本方案

来自 : 蚂蚁淘
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
1.  确定所要转染的细抱系能呈独立集落生长。对于贴壁细胞,在10 cm 组织培养培养皿中接种约100个细胞,培养10~12天,毎4天换液1次。亚甲蓝染色后对成活的细胞集落进行计数。
 
2.  确定母代细胞的选择条件:将一培养皿上生长汇片的细胞按不小于1:15的比例分传于含有不同药物浓度的培养液中。培养10天。用合适的选择培养液每4天换液1次, 并检查活细胞。
 
3.  确定转染母代细胞的最有效的方法。可选用磷酸钙或电穿孔方法。对于磷酸钙转染,在加DNA的前1天,将母代细胞按1:15分传中完全培养液中。
 
4.  用目的基因转染母代细胞,含目的基因的质粒与含标记基因的质粒的摩尔比例不小于5:1。用担体DNA替代含有目的基因的质粒作为对照,分别进行几次转染
 
5.  在无选择条件下让细胞倍增2次。将细胞按1:15分传于选择培养液中。
 
6.  在选择培养液中接种5个以上培养皿,以得到尽可能多的能挑取和扩增成细胞系的细胞集落数,每4天用选择培养液换液,培养10~12天,将培养皿对着光成一角度观察其中的细胞克隆,其中的一只培养皿直可进行染色以便于计算细胞集落数。挑取大的、生长良好的细胞集落。
注意事项
如果用5:1的比例,没有必要在转染前将透择标记基因与目的基因连接起来:如果选择需要用大量的选择性质粒,有时无态保证5:1比例,故要将选择标记基因及所要研究的目的基因构建在同一个质粒中。如果用含有所研究的基因进行转染没有形成克隆,而在含有的对照中却可产生究隆,则所研究的基因能有细胞毒性。
 
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发布于 : 2018-08-07 阅读(10)
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