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제품특징
□QUICK-Clone cDNA
● Library screening 없이 PCR로 직접 원하는 유전자를 cloning 가능
● Human, mouse, rat의 다양한 조직과 세포로부터 합성된 cDNA
● 이전에 분리한 cDNA, 구조적으로 관련된 cDNA 및 종 간의 cDNA를 증폭하는데 적합
QUICK-Clone cDNA는 유전자 특이적인 primer로 원하는 유전자를 증폭할 수 있도록 제작된 double-strand cDNA이다. QUICK-Clone cDNA는 이전에 분리한 cDNA나 구조적으로 관련된 cDNA, cross-species cDNA를 증폭하는데 적합하다. 또한, 목적 cDNA의 증폭의 위하여 library를 제작하고 screening하는 전통적인 방법을 사용하지 않아도 된다. 또한, QUICKClonecDNA는 유전자 특이적인 hybridization용 probe, degenerated primer를 제작할 때도 사용할 수 있다 (1~5).고품질의 cDNA template는 PCR 증폭에 좋은 결과를 가져온다. 고품질의 프리미엄 poly A+ RNA로부터 oligo(dT) primer로 합성된 QUICK-Clone cDNA는 정제 과정을 통하여 잔여 RNA와 400 bp이하의 cDNA를 모두 제거하여 PCR에 최적인 고순도의 double-strand cDNA이다.QUICK-Clone cDNA는 각각 10 ng의 cDNA가 포함된 두 개의 tube로 제공되며, 이는 50 μl PCR 반응 시 20회를 사용할 수 있는 분량이다.QUICK-Clone cDNA User Manual (PT1150-1)은 www.clontech.com/manuals에서 다운로드 받을 수 있고, PCR을 위하여 TITANIUM Taq DNA Polymerase (Cat. Code 639208 & 639209) 또는 긴 서열을 PCR할 수 있는 Advantage 2 Polymerase Mix (Cat. No. 639201 & 639202)를 추천한다.
□ Full-length Human cDNA의 확보
QUICK-Clone II Human Universal cDNA (Cat. No. 639260)은 일반적인 human 조직에서 합성된 30종 이상의 QUICK-Clone cDNA가 섞여있는 제품이다 (정확한 숫자는 조직에 따라 다름). 특히 대부분의 human 유전자를 포함하는 full-length cDNA 증폭에 적합하다.주 : 사용된 library의 source는 lot별로 달라질 수 있다. 각각의 library source에 대한 정보는 Certificate of Analysis를 참고하기 바란다.* QUICK-Clone XG Tumor cDNA는 nude mouse에서 증식시킨 이종이식 인간종양 (xenografted human tumors)에서 합성되었다. 6:149-158.
Figure 1. PCR amplification of the full coding region of the humanTFR mRNA. PCR-amplified QUICK-Clone Human Heart cDNA (Cat. No.637213) was digested with restriction enzymes to verify amplification of the complete coding region of the human TFR gene. Lane 1: no restriction enzyme. Lane 2: Hind III. Lane 3: Hpa I. Lane M1: λ/Hind III DNA size marker. Lane M2: ΦX174/Hae III DNA size marker.
Table I: Tissues Represented in QUICK-Clone II HumanUniversal cDNA | ||
Adrenal Gland | Fetal Lung | Retina |
Aorta | Heart | Salivary Gland |
Bone Marrow | Kidney | Skeletal Muscle |
Brain | Leukocyte | Small Intestine |
Brain,cerebellum | Liver | Spinal Cord |
Brain, cerebralcortex | Lung | Spleen |
Brain,hippocampus | Lymph Node | Stomach |
Brain, thalamus | Mammary Gland | Testis |
Fat Cell | Ovary | Thymus |
Fetal Brain | Pancreas | Thyroid Gland |
Fetal Heart | Pituitary Gland | Uterus |
Fetal Kidney | Placenta | |
Fetal Liver | Prostate |
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RNA聚合酶的作用位点:3'-5'-磷酸二酯键
DNA解旋酶的作用位点:DNA中互补碱基之间的氢键
2、异硫氰酸胍:目前认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活,它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA酶有强烈的变性作用。
3、氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形式过渡类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。
4、RNA酶的蛋白质抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胚盘中提取得来的酸性糖蛋白.Rnasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
5、其他:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定的抑制作用。
不过这种类似的RNA酶清除剂是一种广泛的蛋白灭活剂,如果你配置处理的溶液要用于类似一些酶蛋白的溶液体系,那就不可以用RNA酶清除剂来处理了,否则会影响需要用到的酶的活性
有DNase、RNase、核酸酶S1等,可水解相应的DNA和RNA,核酸酶S1可降解单链DNA和RNA,用量增大也可降解双链核酸。它可用于切去ds-cDNA合成中产生的发夹环。
(2)修饰酶
有些酶可在其他酶的作用下,将酶的结构进行共价修饰,使该酶活性发生改变,
核酶的催化功能与其空间结构有密切关系。
不同的核酶可分为两类:
1 剪切型核酶:只剪不接,如M1 RNA。
2 剪接型核酶:该酶具有序列特异的内切核酸酶、RNA连接酶等多种酶活性。
加工场所在生物体细胞质(或相关实验设备中)。
转录后修饰在生命体中广泛存在(已发现100多种),而假尿嘧啶RNA修饰就是其中最主要的一种。假尿嘧啶在多种非编码RNA(tRNA、rRNA、snRNA等)上的功能与机制已有较多研究;然而,对于信使RNA(messengerRNA,mRNA)上假尿嘧啶的分布和潜在生物学功能,目前知之甚少。最主要的难题,就是如何实现假尿嘧啶在mRNA上的精准定位。
为了研究哺乳动物转录组中的假尿嘧啶修饰,伊成器课题组首先利用高分辨质谱对mRNA中的假尿嘧啶修饰进行定量,发现其广泛存在于各种细胞系及小鼠的组织当中,并且在哺乳动物mRNA中丰度相当高。该研究继而通过化学生物学、高通量测序等手段,发展了“CeU-Seq”—一种利用小分子化合物实现特异性标记与富集的假尿嘧啶高通量测序技术。利用这一技术,该研究成功实现了人细胞系以及小鼠(大脑与肝脏组织)全转录组水平的单碱基分辨率假尿嘧啶检测,发现在数千个mRNA与长非编码RNA(lncRNA)上都含有假尿嘧啶修饰。该研究进一步确定了多个可以作用于mRNA上的假尿嘧啶合成酶(其中PUS1、DKC1两种酶之前被发现与线粒体肌病、先天性角化不良等人类疾病相关),并且发现转录组中假尿嘧啶的含量与分布均会受到各种环境刺激的调控,呈现出“刺激条件特异性”的诱导修饰。因此,该研究不但揭示了假尿嘧啶的广泛存在、绘制了转录组中假尿嘧啶RNA修饰的高清谱图,也为这一转录后修饰参与基因表达调控的研究提供了重要工具、为近年来兴起的“RNA表观遗传学”领域提供了崭新的研究方向。
北京大学生科院博士生李笑雨(PTN-BBS联合培养项目)、生命中心博士生朱平、博士生马士清是这篇论文的并列第一作者,生命科学学院伊成器研究员是该论文的通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、科技部973计划和北大清华生命科学联合中心的资助。
原文链接:http://www.nature.com/nchembio/journal/vaop/ncurrent/full/nchembio.1836.html
详情:http://www.bioku.cn/201212/science-cirp-circADIan-gene-clip-posttranscriptional-modification-fibroblast/
在哺乳动物组织中,节律基因的表达受到局部的振荡器或视交叉上核中生物钟主钟控制的系统信号的调控。本研究发现是受刺激的体温循环而不是外周振荡器,控制纤维母细胞中的冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的节律性表达。反过来,功能缺失性实验表明CIRP是高振幅的节奏基因表达所需的。利用基于生物素-链亲和素的交联和免疫沉淀反应(CLIP),本研究对CIRP结合的RNA进行了全转录组分析,发现了一些编码昼夜节律振荡器蛋白的转录物,包括CLOCK蛋白。此外,在CIRP缺失的纤维母细胞中,CLOCK的含量大大减少。因为在这些细胞中,CLOCK的异位表达提高了节律基因的表达水平,因此我们猜测CIRP通过调节CLOCK的表达水平赋予了昼夜节奏振荡器的健壮性。
比如用QIAGEN的RNase-free的DNase处理的,不是加了DNase就结束了,为了去除DNase(蛋白)和buffer等可能影响到后期操作的因素,所以酶解了DNA后必须纯化RNA(QIAGEN的纯化柱),这样得到的RNA才用于定量实验。即使这样,在做real-time PCR时都要加一管仅加RNA的作为阴性对照(排除DNA的污染)。
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