位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程实验一位点特异性核酸内切酶的蛋白质工程
| 实验材料 | pMQ402 试剂、试剂盒 | 阿拉伯糖苯甲基磺酰氟Ni-NTA琼脂糖结合缓冲液清洗缓冲液洗脱缓冲液透析缓冲液 仪器、耗材 | 超声破碎器冷冻离心机 实验步骤 | 3.方法 此处列出的方法概括了为定点突变而做的氨基酸位点选择（见3.1)、为在细菌细胞中表达而做的MutH蛋白突变（见3.2)和MutH变体的鉴定（见3.3)。 3.1为定点突变对氨基酸的选择 从生物技术信息国家中心基因组基本局部比对搜索工具（basic local alignment searchtool，BLAST)页面（http://www. ncbi. nlriLnih. gov/BLAST/)[24]得到MutH蛋白和相关限制性内切核酸酶的序列。更多的序列从PSIBLAST服务器[25]得到。使用PAM250矩阵，用ClustalX程序比对序列。比对好的序列用GeneDoc程序分析[27]。程序的使用方法可在程序内使用“Help”功能得到。结构的坐标从PDB数据库（http: //www. rcsb. org/pdb/)得到。程序RasWin和Swiss PDB viewer用于结构观察。 3.1.1与DNA结合有关的保守残基团的辨别 在序列比对（如用ClustalW或ClustalX)之后，完成下列步骤。 (1)将比对结果输入GeneDoc程序（见2.1；参考文献[27])。 (2)用“Group”功能将序列分组（如一个组包含MutH，而另一个组包含限制性(切核酸酶)。 (3)鉴别组特异的残基（见注1)。 (4)用GeneDoc内的“RasMolScript Dialog”功能，生成RasMol执行文稿，以将组特异残基映射入（标记在）MutH蛋白结构中。 (5)将MutH结构载入RasMol程序（见2.1；参考文献[28])，在“RasMolCommand Line”用“Script”命令执行从GeneDoc输出的文稿，以观察组特异残基。 (6)辨别位于假设为DNA结合位点的候选残基。 3.1.2辨别接触特定碱基的残基 (1)下载限制性内切核酸酶与DNA底物（或产物）形成复合物的现有序列。 (2)运行SwissPDBviewer，以3个催化残基（如MutH的D70、E77和K79)的主链原子为种子，将限制性内切核酸酶结构与目标MutH结构进行匹配。 (3)用“Improve fit”功能增强拟合效果。 (4)将重叠结构的坐标输出到电子制表程序。 (5)计算目标蛋白（如MutH)的任意原子到重叠结构中碱基的距离，此碱基对应于目标蛋白中的目标碱基。 (6)对所有重叠结构，重复这些步骤。 (7)计算平均距离，并辨认对感兴趣碱基距离最近的残基。 (8)将结果与组特异残基分析比较。 (9)为定点突变选择有希望的残基。 3.2MutH变体定点突变 MutH变体的克隆，采用如Kirsch和Joly所述[29]修改过的QuikChange操作规程(Stratagen)，用质粒 pMQ402(来自Dr.M.G.，University of Massachusetts MedicalSchool，MA)为模板，以及两个寡聚脱氧核苷酸用于突变以适合于产生长度在50~500bp的PCR产物（见注2)。 3.3MutH变体的纯化和鉴定 为了适合于体外测试，MutH变体必须得到纯化。 3.3.1从细菌细胞纯化MutH变体 (1)用细菌质粒以标准分子生物学方法转化XL-1BlueMRF细胞。 (2)将细胞平铺在含有氨苄青霉素的LB培养板上，于37°C过夜培养。 (3)选一单菌落，在500ml含75μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，于37°C生长。 (4)在600nm处光密度值为0.8时，于28°C，用0.2%(m/V)阿拉伯糖（终浓度）诱导2.5h(见注3)。 (5)以3000g离心细胞10min。 (6)重悬细胞团于10ml结合缓冲液中[见2.3(9)]。 (7)用Branson超声机，输出级5，占空率50%，超声破碎悬浮物5次，每次1min。每次超声间歇冷却溶液1min。 (8)在冷冻离心机上，以30000g离心细胞碎片30min。 (9)于4°C，将上清液与Ni-NTA琼脂糖浆柔和地混合30min。 (10)将Ni-NTA琼脂糖移至一空柱中。 (11)用20ml清洗缓冲液冲洗该柱[见2.3(10)]。 (12)用0.5ml洗脱缓冲液[见2.3(11)]洗脱。没有必要切除His标记，因其不干扰内切酶活性（见注4)。 (13)以在280nm处的光密度值作为判断依据，收集合并得到的每份蛋白质。 (14)于4°C，用500ml透析缓冲液[见2.3(12)]透析样品最少2h。换缓冲液2次。 (15)用500ml透析缓冲液G[见2.3(13)]透析样品。 (16)在透析缓冲液[见2.3(12)]中以1:10比例稀释样品，测量280nm处的光吸收，以便用理论消光系数计算MutH的摩尔浓度[30]。 (17)于-20°C保存蛋白质。 3.3.2MutH的切割分析 用含有未甲基化、半甲基化或全甲基化的单个d(GATC)位点（图7.3)的DNA底物（用它处所描述的方法合成的寡核苷酸，或者PCR产物，参考文献[19]和[20])来开展MutH和MutH变体的切割分析。用不同的荧光染料、（分别用FAM和TET)标记底物上下两端的链，以便检测每条链上的切割。  (1)10nmol/L浓度的DNA底物在10μl含有500nmol/L的MutL和浓度在10~500nmol/L的MutH的测试缓冲液（见注1；误，似应为2.4节，第1条——译者）中保温（见注5)。 (2)反应混合物于37°C温育。 (3)以适当的时间间隔（10s到30min)分装反应混合物，每份含25fmolPCR产物，与12μl模板抑制剂（Perkin-Elmer)和0.5μlGene-Scan-500TAMRAsizestandard (Perkin-Elmer)充分混合。 (4)加热到95°C2min，并立即在冰上冷却。 (5)在配有47cm(内径50μm)毛细管（其中含有加了8mol/L尿素的POP-4聚合物（Perkin-Elmer))的 ABIPRISM310基因分析仪（Perkin-Elmer)上分析样品。 (6)用5s，将样品电注入毛细管，使用电压15000V，并在15000V和60°C、使用1X基因分析缓冲液外加1mmol/LEDTA (Oerkin-Elmer)作为电极缓冲液，使用30min完成跑电泳过程。 (7)记录切割的和未切割的荧光标记的DNA数量（图7.3)。 (8)测定切割速度。 |
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发布于 ： 2019-06-26
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