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毛细管电泳在二代测序（NGS）文库质控中的应用

来自 : mayitao

近年来，二代测序（NGS）以其快速、高准确率和低成本的优势逐渐替代了一代测序，不断蓬勃发展。市场中上主流的NGS平台包括IlluminaSolexa、Roche454、ABISOLID和LifeIonTorrent。NGS使基因检测产业化成为了可能，现已广泛应用于产前诊断、肿瘤及多种遗传病的预防与治疗。为了得到良好准确的测序结果，减少测序过程中不必要的尝试，降低测序成本，上机测序前要求必须了解测序文库样品的大小分布和浓度。因此，文库质控至关重要。

琼脂糖凝胶电泳是检测文库的大小及分布的传统方法，文库的浓度信息则通过qubit、Nanodrop或实时荧光定量PCR获得。NanoDrop检测浓度时易受杂质吸光的影响，因此不建议其读数作为后续建库的参考。Qubit采用的荧光染料只与靶分子结合，检测结果相对精确。实时荧光定量PCR能够对扩增文库中的分子进行高度精确的定量检测；另外，其灵敏度非常高，可以对低浓度的文库样本进行定量检测。因此，这种方法能尽量减少文库扩增的循环数，降低错误率和偏差。

数字PCR也能够对二代测序的文库进行高精度的绝对定量检测，但成本高昂。这种方法不需要标准品，是在PCR扩增之前对样品进行微滴化处理，将DNA或CDNA样品分成上万个微滴，其中每个微滴或不含DNA靶分子，或含有一个或数个靶分子。每个微滴作为一个单独的PCR反应，利用终点法PCR对DNA进行扩增。在扩增后，分析每个微滴中荧光信号的存在（阳性）或不存在（阴性）。根据泊松分布原理及阳性微滴的比例可确定样品中靶分子的绝对数量。但是，这种技术需要特殊的仪器，并且花费较高，因此尚未广泛用于文库定量检测。

值得一提的是，随着测序相关技术的不断进步，繁琐冗长的琼脂糖凝胶电泳已逐渐退出核酸质控领域。目前，基于微流控芯片或毛细管的电泳分离技术越来越广泛地应用于DNA片段的大小和浓度的检测，自动化的电泳仪应运而生。这些仪器操作方便，通量高，灵敏度高（对于检测的限制更少）。除此之外，此类设备可实现全自动化输出电子数据，避免了人为操作的失误。然而，相较之下，毛细管电泳分离技术可以省去微流控芯片制胶、点样等繁琐的加工和操作步骤，亦可降低使用成本，前景较好。

毛细管电泳(capillary electrophoresis， CE)，又称高效毛细管电泳(HPCE)，是利用带电性不同的粒子在电场中迁移，在泳动过程中物质的各组分被分离。被分离物质的迁移率取决于分子的结构、形状和电荷数量等因素，同时受溶液pH值、离子强度、粘度和两性电解质因素的影响。

现在市面上常见的利用毛细管电泳技术进行核酸片段分离的分析仪有台湾光鼎公司的Qsep100系统、凯杰公司的QIAxcel系统、AATI公司的FragmentAnalyzer等。

几款仪器在对检测片段范围上的没有太大的差异，主要集中在15bp-12kb之间。在检测的通量方面，QIAxcel系统最多可以一次性检测12-96个样本，建议每次上样量为12个样本的倍数。卡夹基于高通量的设计，样本量较大时，使用起来更为经济合理；AATI-FragmentAnalyzer最多可检测288个样本，上样量要求12个或96个样本的倍数；而Qsep100系统采用是单卡夹上样设计，使得检测样本的通量更灵活，1-108个样本同时上样逐个检测。在检测的灵敏度方面，QIAxcel系统可达0.1ng/µl；AATI-FragmentAnalyzer的高灵敏度试剂盒可检测至5-50pg/µl；Qsep100系统标准DNA卡夹可达5pg/µl（Singlefragment），高敏DNA卡夹可检测至4pg/µl（smears）。在上样形式方面，QIAxcel系统采取全自动上样，最低要求体积15µl；AATI-FragmentAnalyzer自动上样，上样体积要求20µl以上；Qsep100系统采取全自动上样，配有超微量管，最低体积要求1µl，样本消耗量小于0.1µl。

另外，基于微流控技术的Agilent2100生物分析仪在NGS市场应用也比较多，被称为行业标准。通量上每次检测12个样本，样本量不足12个需凑齐，否则造成浪费，无形中增加成本；在检测灵敏度上，2100生物分析仪高敏芯片可检测5-500pg/µl浓度的样本；在操作上需手工将样本点入芯片，要求上样体积1-4µl。

毛细管电泳在NGS过程中的应用，包括建库前的genomicDNA、RNA质控，片段化DNA以及文库质控等环节。以下是采用毛细管或微流控芯片电泳技术得到的常见类型文库的理想峰图：