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2006-10-27【求助】紧急求助!标准曲线制作

问题描述:

我是一个新手。做了两次real-timePCR(SYBRGREENI)标准曲线都很差劲,请好心的大侠们帮忙指点迷津。

标准品是用质粒DNA做了。第一个图是按10倍梯度进行稀释,以10^3~10^9copy/μl7个浓度的标准模板系列作为标准品;第二个图是按10倍梯度进行稀释,以50~0.0005ng/ul6个浓度的标准模板系列作为标准品,得到的标准曲线的参数值分别是R^2=0.87998694<0.99,Slope=-1.403786(图一);R^2=0.9702126<0.99,slope=-1.5033078.

我应该从哪些方面来改进我的实验?紧急求助!

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用户答案

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yulanwang
用户
建议:回复时间:2006-11-04

我想从两个方面来回答你的问题,一,你的质粒标准品在进行稀释时,你稀释的准确吗,一般是多取一点原样进行稀释以减少稀释误差;二,你用的荧光染料SYBRGREENI,此种染料可以跟所有的双链DNA结合,包括引物二聚体,包括其它的非特异性扩增,不知道你分析了你的熔解曲线了没有,看看是不是只有一个峰?建议你把你的熔解曲线的图也传上来。标准曲线好的话一般要求R^2=0.99以上呢,至少应该是两个9。

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winne_jin
用户
建议:回复时间:2006-10-27

谢谢你。我是在别人实验室做的real-time,没有要到SDS的安装软件。明天我去把融解曲线拷下来,再请你看看。
可能我稀释不准确,我是用TE稀释的,取1ul50ng/ul的溶液+9ulTE得到5ng/ul的溶液,再从1ul5ng/ul的溶液+9ulTE得到0.5ng/ul的溶液,以此类推,得到7个浓度的标准模板系列。是不是稀释不准确?

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winne_jin
用户
建议:回复时间:2006-11-03

第二张图如下

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