细胞凋亡检测实验一Caspase3活性检测法
| 实验方法原理 | Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 细胞 试剂、试剂盒 | Ac-DEVD-AMC磷酸缓冲液蒸馏水脱脂奶粉Caspase-3多抗吐温 仪器、耗材 | 硝酸纤维素膜PVDF膜荧光分光光度计UV流式细胞计烧杯移液管引流棒 实验步骤 | 一、Westernblot分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。 1. 方法 收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05%Tween20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→TBS-T洗3次，5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。 2. 结果   二、荧光分光光度计分析 1. 原理 活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。 2. 方法 收获细胞正常或凋亡细胞→PBS洗涤→制备细胞裂解液→加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽荧光底物）→37°C反应1h→荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。 3. 结果  三、流式细胞术分析 1. 方法 收获细胞正常或凋亡细胞→PBS洗涤→加Ac-DEVD-AMC→37°C反应1h→UV流式细胞计分析caspase-3阳性细胞数和平均荧光强度。 2. 结果  |
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发布于 ： 2021-07-14
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