| 实验方法原理 | |||||||||||
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| 实验材料 | Cy3－和Cy5－标记的CDNA玻璃微阵列 试剂、试剂盒 | DEPC处理的水SDSSSC酵母tRNADenhardt溶液 仪器、耗材 | 热循环仪65℃水浴芯片杂交盒图像分析软件 实验步骤 | 实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」 1.计算所需要的杂交液体积。 计算体积的经验是盖玻片所覆盖的每平方毫米载玻片面积需要0.033ul杂交液。一个24mm×55盖玻片需要40ul杂交液。所加的杂交液应能足以产生无气泡的平整支撑面，这样盖玻片就与载玻片各处的距离一致。 2.每个40的杂交体系中，将Cy3和Cy5标记的cDNA加入一个0.2ml薄壁PCR管混合，并加入DEPC处理过的水或用Speedvac蒸发仪除去一些水使它们的体积达到30ul。 3.按下面所列组分配制每一份40的杂交体系： 4.吹吸使所有组分混匀，在热循环仪上98℃加热2min，快速降温到25℃，并加入0.6ul10％SDS。 5.20～25℃16000g离心5min，使凝聚的部分沉淀。 6.把标记的cDNA小心地加到24mm×50mm盖玻片上，然后与倒转朝下的芯片相接触。 7.把玻片放入一个芯片杂交盒。如果盒中有池，在池里加入5ml3×SSC；如果无池，加在玻片有标记的那一端。封好杂交盒。将盒子浸入65℃水浴中杂交16～20h。 8.从水浴中拿出杂交盒，冷却并仔细拭干，以免外面的水分在盒子打开时进到内部。打开杂交盒拿走玻片。 9.将玻片和黏附在一起的盖玻片一起放入盛满0.5×SSC/0.01％SDS洗液的Coplin缸内。此时盖玻片会从玻片上落下，用镊子捡去。玻片在缸子里洗2～5min。 10.把玻片转入另一个盛满0.06×SSC的Coplin缸内洗2～5min。根据RNA样品来源不同，洗涤的程序可能需要调整以更有效地去除噪声。第一步插入用0.5×SSC/0.1％SDS洗涤或将常规的第一步洗涤重复一次都是有帮助的。 11.将玻片转移到玻片架上，在带有可离心培养板的水平转子的临床离心机上低速离心（167g或700～1000r/min）3min。 根据所用型号和厂家不同，调节芯片显像设备的细节会有很大差别。同样地，许多方法都可以用于识别图像中的信号、调整背景水平，以及标化两个通道中的数值。这个部分只是想给出一些显像中整体考虑的原则。 12.调节光电倍增器的电压和激光的功率使最强的信号只略低于读数上限［如果是16位（16－bitscale）那么就是65535］，而背景值（排布的点与点之间）一致略高于0。然后收集整个图像的数值。 13.将捕获的图像输入数据抽取软件。检査杂交的整体质量：注意一致性和背景水平、信号水平和分布情况、每个通道信号的相对强度以及大多数基因信号之间的可比性如何。 注意事项 | 除非特别说明，所有溶液用无RNA酶的水（如DEPC处理过的水）配制。 其他 | |
