蛋白质的短暂表达实验一基本方案
| 实验材料 | 载体 试剂、试剂盒 | 牛血清DMEM葡聚糖PBSDMSOEDTA 仪器、耗材 | 培养皿培养箱相差显微镜离心机 实验步骤 | 1. 将目的基因亚克隆至合适的载体中得到所需的重组DNA，用小量法（5ml培养物）或用CsCl/溴化乙锭离心法纯化重组DNA。 2. 将在DMEM-10CS中生长汇片的COS-7细胞（每100mm培养皿约细胞）在转染的前一天以1：5的比例分瓶，这样第二天细胞将长至约50%汇片的程度，让细胞在CO2培养箱中于37℃生长过夜至约50%汇片。 3. 使用前（相应于待转染的每一个100mm平皿的COS细胞）将55ml37℃的DMEM-10NS培养液与5~10μg重组DNA彻底混匀，再加入0.2ml 葡聚糖/氯喹溶液，混匀。 4. 吸出COS细胞的培养液，向每一个100mm 平血加入步骤3制备的DMEM-10CS/DEAE-葡聚糖/DNA。在CO2培养箱中，37℃温育细胞3~4h（可能需要优化），用相差显微镜观察细胞。 5. 吸出DMEM/DEAE-葡聚糖/DNA，加入5ml10%DMSO（用PBS配制），室温温育细胞2min。吸出DMSO并加入10mlDMEM-10CS。让细胞在培养箱中于37℃生长过夜（12~20h）。 6. 将毎个100mm平皿中转染的COS细胞传代至两个新的100mm平血。按步骤7a或7b于37℃温育细胞。 7a. 当表达分泌蛋白时，在完成步骤6后96h，加入5mlDMEM-10CS并培养4天。收获培养液，室温下以约1000g离心10min，除去死细胞和碎片，保留上清液，用代谢标记、免疫沉淀、免疫亲和层折、放射免疫、免疫印迹或生物学鉴定来检测分泌蛋白质。 |
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发布于 ： 2018-08-03
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