细胞周期的检测(Paganoetal.2000)

细胞计数

1)试剂

0.25%胰蛋白酶溶液、无血清培养液。

2)设备

显微镜、计数板。

3)操作规程

(1)准备计数板：用乙醇清洁计数板和专用盖玻片，用绸布轻轻擦干。

⑵制备细胞悬液：制备单个细胞悬液。本法要求细胞密度不低于IO⁴个/ml。如果细胞数很少，应将悬液离心，重悬浮于少量培养液中。

(3)加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

⑷计数：在显微镜下，用IOx物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。
计算：细胞数/毫升原液=(4大格细胞数之和/4)xl〇⁴x稀释倍数。

4)注意事项

⑴消化单层贴壁细胞，要分散良好。

(2)取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤其要注意这一点。镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占K)%以上，说明消化不充分，或细胞数少于200个/IOmm²或多于500个/IOmm²时，说明稀
释不当，需要重新制备细胞悬液。

5)结果判读

一般根据计数结果能够绘制出细胞的生长曲线，从而算出倍增时间。值得注意的是，倍增时间只能反映细胞周期，但是并不等同于细胞周期。

细胞生长曲线

1)原理

只有生长稳定的细胞才能绘制细胞生长曲线(司徒镇强等1996)。此处介绍用MTT法来进行生长曲线测定的方法。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长测定其OD值，可以间接反映活细胞数量。在一定范围内，MTT结晶物形成的量和细胞数成正比。此方法灵敏度高、重复性好、操作简单且没有放射性污染。

2)试剂

(1)MTT溶液:称取250mgMTT，加人50mlPBS(0.01mol/L，pH7.4)，磁力搅拌3〇min，
用0.22um的滤器除菌，分装，代保存。2周内有效。
(2)含10%胎牛血清的RPMI1640培养液、0.25%胰蛋白酶、DMSO。

3)设备

显微镜、振荡仪、酶联免疫检测仪、96孔培养板、移濟器、吸管、离心管。

4)操作规程

(1)接种细胞、培养细胞。

(2)呈色：培养3〜5天后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮培养的细胞，需要离心、弃去孔内培养液。每孔加入150ulDMSO,振荡lOmin，使结晶物充分溶解。

(3)比色、记录结果。以时间为横轴、光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。

5)注意事项

(1)选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对细胞要测定其贴壁率、倍增时间和不同接种细胞数时的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止时不致细胞过满。这样才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。

(2)避免血清干扰。一般选择小于10%胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余的培养液。

(3)设定空白对照。与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，其他试验步骤保持一致。最后呈色时，以空白孔为零。

6)结果判读
细胞周期与细胞群体倍增时间是不同的概念。倍增时间是指在对数生长期细胞数量增加1倍所用的时间，这一时间内一般有些细胞参与分裂，有些细胞可能不分裂，有些可能分裂两次或数次，但是细胞总数增加1倍。一般来说，细胞周期短于细胞倍增时间。

流式细胞术

原理

流式细胞仪能够分析细胞或颗粒物的各种参数，如DNA、RNA、蛋白质含量及这些物质在细胞周期中的变化。用DNA直方图可以得网细胞周期中各时相细胞的百分比及DNA含量。G₀/G₁期细胞的DNA含量是2n，G₂/M期细胞的DNA含量是4n，S期细胞的DNA含量介于2n和4n之间。

在细胞周期中用PI单独染色无法将G₀、G₁期细胞分开，可以用DNA/RNA双染色将两者分开，这是因为G₀期细胞不合成RNA。

流式细胞仪还能够定量细胞总蛋白、定量细胞特定功能蛋白、定量细胞内钙离子等，结合细胞周期的检测，可以观察这些物质在细胞周期中的变化

操作规程

1)制备单个细胞悬液

⑴悬浮生长细胞。用PBS洗漆、配制成IxlO⁶〜2xl〇⁶个/ml的细胞悬液备用。

(2)单层培养的细胞。通常采用酶消化法分散细胞，制成单个细胞悬液，备用。

(3)实体组织可采用机械法、化学法、酶消化法分散组织细胞。通常是联合应用。细胞悬液用PBS洗涤，备用。

2)样品固定
除了分选活细胞或分析活细胞外，都应该固定细胞。
⑴甲醛法：在细胞悬液中，加人等体积的8%甲醛-盐水G，代固定12〜18h。常用于Fuelgen染色。

⑵乙醇法：细胞悬液离心，弃上清，用5ml4℃预冷的盐水G重悬，缓慢加入-20℃的95%乙醇15ml，使其终浓度为70%，冰浴30min。常用于Hoechst、溴化乙键、碘化丙锭(PI)、异硫氰酸荧光素等染色。

(3)丙酮法：用生理盐水悬浮细胞，加入冷丙酮，使其终浓度为85%。常用于免疫荧光染色。

盐水G的配制：葡萄糖1.lg、NaCl8g、KCl0.4g、Na2HPO4•12H200.39g、KH2P〇40.15g，加蒸馏水至1L。待完全溶解后，称取MgSO4JH2OL54g、CaCl2.H2O0.16g，依次溶解于上述IL盐溶液中。

3)细胞染色

这里仅介绍几种常见的染色。
(1)PI染色。PI能嵌人双螺旋之间，不能通过完整的细胞膜。在染活细胞时要将细胞固定或打孔，另外，染DNA时需要用RNA酶处理细胞。激发波长为488nm。

a.PI15mg，枸橼酸钠O.lg，NP-400.3mI，加蒸馏水至100ml,4℃避光保存。

b.将等体积的单细胞悬液和PI染液混合，4℃放置15——20min。

c.测量前将样品用300目尼龙膜过滤。

(2)光辉霉素(MI)染色。MI只与DNA以非共价键结合。激发波长为488nm。
a.MI染液的配制：商品MI每支含MI2.5mg，用15mmol/LMgCl2及150mmol/LNaCl溶液将MI配制成100pg/ml溶液，4℃避光保存。

b.制备单细胞悬液：活细胞悬浮于含有5%——10%胎牛血清的培养液中；经70%乙醇固定的死细胞悬浮于生理盐水。细胞密度为IO⁵〜IO⁷个/ml。

c.将细胞悬液与等体积的MI染液混合，室温染15——20min。

d测量前将样品用300目尼龙膜过滤。

<3)DNA和RNA双重染色。
a.制备活细胞悬液，悬浮于培养液或PBS中；用蒸馏水溶解Hoechst33258,用PBS稀释成lmmolTL的储存液，代避光保存。

b.将5UMol/L的Hoechst33258染液与等体积细胞悬液混合，37℃，避光60〜90min。

c.继续加人5umol/L的PY染液，37℃静置45min。

d.IOOOg离心lmin，除去染液，用RPMI1640培养液悬浮细胞。

e.用紫外光(351〜363nm)激发Hoechst33258测定DNA，用476nm波长激发PY测定RNA。

4)注意事项

⑴在制备样品时，离心次数不要过多，防止细胞丢失或凝集成块。

(2)消化细胞时应该注意各种不利因素，注意酶的浓度和活性。

(3)细胞固定时间不能过长。不要使用冰醋酸-乙醇、苦味酸及含汞固定剂。

(4)调试FCM时，应使用理想的标准品，以便获得较高的分辨率。

分离、检测处于不同时相的细胞

离心淘洗法

1)原理
有些细胞』处于不同时相时的体积和重量会有明显差别，可以通过密度梯度离心来分离。该方法操作简单、省时，得到的细胞群体均一性较好，成本低，并且不扰乱细胞生长。但是，对于多数种类的细胞并不适用。

2)操作规程
(1)细胞培养⑵淘洗前将处于对数生长期的细胞用胰蛋白酶消化，并重悬于20ml(5ml分离室)或100ml(5〇mI分离室)冷的组织培养液中。

(3)分离所需的最佳细胞数，5ml分离室为4xl〇⁷〜6xl0⁷个细胞，50ml分离室为
4XlO⁸〜6xl〇⁸个细胞。

(4)这里给出分离CHO细胞的步骤：

a用冰浴冷却的含血清的完全培养基淘洗(血清含量根据细胞类型的不同来决定)。

b.调转速和流速，使细胞停留在分离室。

c.借助泵的作用加入样本，不要使标本进入气泡清除室。

d.加样后即开始收集每一个转速下洗脱出的液体，转速的增加要使各组分洗出细胞的体积稳步增加。
e.分离过程中，每一流分细胞数、细胞体积均需检测。

f.对每一流分，从体积分布以校准常数求出中位数体积。校准常数由统一大小和密度的乳胶颗粒推导出。

g.以体积中位数为基准，选择处于不同时相的细胞以备进—步研究。每一流分的均一性都用流式细胞仪来评估。

3)注意事项
淘洗系统应在实验前12〜24h内消毒，以免细菌或酵母污染。

M期细胞振荡脱落法
1)原理
单层生长细胞在M期变圆，对瓶壁的锚着减弱，易于游离到悬浮液中。该方法不干扰细胞生长，但是分离的细胞数少且只能用于贴壁生长的细胞。

2)操作规程
轻轻摇动或在边台上叩击培养瓶。使培养液冲刷瓶壁，然后吸出培养液以收集頁期M胞。从各培麵中收集培养液、集中、离心，使皿期细臓积林。细胞重悬用流式细胞仪来评估均一性，供进一步的分析。

药物诱导同步化——同步化在G0/G1期

1)原理

血清撤离可以使细胞停滞在G0期，添加后重新进人细胞周期。

2)操作规程
⑴以汇合密度的3〇%重悬细胞、培养，血清浓度依细胞种类的不同选定，一般是0——0.5%

(2)血清饥饿24〜48h后，细胞进人G0期样的状态
。
⑶重悬细胞，用含血清培养基培养，细胞将重新进入细胞周期不同时间取样流式细朦评估均—性

3)注意事项

⑴首先蔚請楚雛生长細麵倍獅间雜可麵的汇合優大细胞

(2)血清撤出需要掌握最佳的撤除量及撤除时间

(3)有些细胞不适合用血清饥饿法。°

药物诱导同步化一同步化在G1期早期

1)原理

Lovastatin抑制HMG-CoA还原酶，可使细胞停滞在极早的G1期。

2)试剂

用95%乙醇稀释Lovastatin到50mg/ml，溶液中加入lmol/L的NaOH调高pH，再用lmol/L的HCl中和。活化后用无菌去离子水稀释至10mm〇l/L，-20℃储存备用。

3)操作规程

(1)以最大细胞密度的30%培养细胞，培养液中加入Lovastatin。浓度依照细胞种类的不同而调整，一般是10〜60umol/L。

(2)用PBS洗2次以解除Lovastatin的作用，然后用含有甲经戊酸的培养基培养，密度是汇合密度的30%——40%。甲轻戊酸的浓度应在所用Lovastatin浓度的1〇〇倍以上。

4)注意事项
很多细胞经Lovastatin处理后，在恢复中G1期被延长了。

药物诱导同步化一同步化在G1期晚期

1)原理

Mimosine是从植物中获得的，能将细胞阻滞在G1期晚期。

2)试剂
Mimosine用PBS溶解，终浓度是100mmol/L，4℃储存备用。

3)操作规程

(1)指数生长期细胞在含1〇〇〜400^imol/LMimosine的培养液终，培养16——24h。

(2)用PBS洗2次，解除Mimosine的阻滞作用，以汇合密度的30%〜40%重悬于培养液中，继续培养。

药物诱导同步化—同步化在G1/S期交界点

1)原理
TdR是DNA合成抑制剂，加人TdR后一段时间，所有细胞将处于S期，但是可能处于S期的任何时期。

2)操作规程

(1)用PBS将TdR稀释，过滤除菌，-2O℃储存备用。

⑵将指数生长期细胞用含有2mmol/LTdR的新鲜培养液培养(TG2+TM+TGl)，此时细胞位于G1A期交界点和S期的任何时期。

(3)用PBS洗2次，解除TdR的抑制作用。用新鲜培养液培养一段时间(要小于tG1)，使得原来处于S期末的细胞没有进入S期，原来处于G1A期交界点的细胞离开s期。

⑷再次进行TdR抑制，l2——l4h。这时所有细胞都处于G1A期交界点。取样，用流式细胞仪评估细胞周期时相。

(5)除去二次TdR的抑制作用，释放后不同时间取样，可以获得需要的、位于不同时相的细胞，用流式细胞仪评估后，可供进一步检测。

3)注意事项
这是应用最广泛、也是最被认可的细胞周期同步化技术。第一次的释放时间长短是至关重要的。

M期细胞同步化

1)原理
用秋水仙素、秋水仙胺或nocodazole等，能抑制细胞分裂，将细胞阻断在M期。该法常常与M期细胞振荡脱落法联合应用。

2)注意事项

(1)由于该方法常常造成细胞的不可逆变化，所以此方法有一定争议。

(2)药物浓度、作用时间都需要摸索