| 实验材料 | 磷酸化多肽样品在溶液中保存 试剂、试剂盒 | 乙腈碱性磷酸酶甲酸MALDI基质三氯乙酸 仪器、耗材 | 台式离心机去盐树脂MALDI靶板质谱仪塑料盒加样吸头注射器 实验步骤 | 方法A:在MALDI-MS分析之前在溶液中去磷酸化的方法1.根据方案1中的附加方案，准备两个nanoscale去盐柱子（PorosR2或PorosR3)。在孵育期间，用5%的甲酸保证树脂湿润（第3步），GELoader?吸头的上端作为一个反应室。 2.在每一个反应中，加20ul碱性磷酸酶到50mmol/LNH4HCO3中，然后再稀释1~2ul的多肽样品到碱性磷酸酶溶液中（最后反应溶液的PH为8左右，必要时用50mmol/LNH4HCO3进行调整，也可以用pH试纸检测）。
3.GELoader吸头于37°C孵育45min，使多肽去磷酸化。 4.加入2ul15%的甲酸，酸化样品，通过注射器施压把样品加到Poros树脂上。 5.用20ul5%的甲酸洗涤柱子，然后再用1ul饱和的MALDI基质洗脱柱子，为得到较好的敏感性，把洗脱液按5?8小滴加到MALDI板上，第1、2滴是主要分析的组分。 6.分别记录从第⑤步中得到的样品及对照组样品中的一部分磷酸化多肽的MALDI反射-TOF和MALDI线性-TOF谱图。 方法B:MALDI-MS分析后在溶液中去磷酸化此法对于DHB和CHCA两种MALDI-MS基质都适用。 1.根据方案1中的附加方案，准备两个nanoscale的去盐柱子（porosR2或PorosR3)。在孵育期间（第④步），用5%的甲酸保证树脂潮湿。 2.用GELoader吸头的上端作为一个反应室。在每一个反应室中加204碱性磷酸酶到50mmol/LNH4HCO3中。
3.记录多肽混合物的MALDI反射-TOF和MALDI线性-TOF图谱。 4.用微量加样器取0.5~1.5ul的70%乙腈+0.05mol/LNH4HCO3小心溶解分析物/基质结晶，把等体积的溶解的分析物/基质结晶直接转移到每一个反应室里。 为成功得到分析图谱，不锈钢表面的MALDI板必须是「磨光」的或是AnchorChip0 5.GELoader吸头在37°C孵育45min，使多肽去磷酸化。 6.加人2倍体积的5%的甲酸，酸化样品，通过注射器施压把样品加到Poros树脂上。 7.用20W5%的甲酸洗涤柱子，用1ul饱和MALDI基质洗脱柱子，为得到最佳的敏感性，把洗脱液按5~8小滴加到MALDI靶板上，第1、2滴是主要分析的组分。 8.记录碱性磷酸酶处理的多肽的MALDI反射-TOF和MALDI线性-TOF谱图 方法c:MALDI-MS分析后在靶板上去磷酸化此方法仅适用于CHCAMALDI-MS基质。 1.分析分析物/基质结晶中得到MALDI反射-T0F和MALDI线性-TOF谱图后，用1.5ul含有0.05U/ul碱性磷酸酶的0.05mol/LNH4HCO3溶液在靶板上溶解基质。 2.将靶板放置于一个封闭的塑料盒中，盒中放置湿的织物，以防样品干燥，37°C孵育30min。 3.用0.5ul5%TFA酸化样品，这样是为了使基质再结晶。 4.在MALDI分析去磷酸化多肽之前，用0.1%TFA轻轻洗涤基质微晶体的表面，以洗掉来自去磷酸化缓冲液中的盐分和甘油，将10ul0.1%TFA滴到基质上，静置片刻后迅速用织物的边缘去除TFA溶液。 |
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