| 实验步骤 |
蛋白A通常用于人（除IgG3夕h小鼠IgG1结合力也较弱）、兔、豚鼠和猪抗体的纯化。 材料腹水或MAb上清（单元1.4) PBS,pH8.O和pH7.3 lmol/LNaOH 蛋白A交联琼脂糖凝胶CL-4B(PharmaciaBiotech或Sigma) 0.lmol/L柠檬酸，pH按照所分离的抗体亚类的需要而定（步骤3) 10%(m/V)NaN3(可选） V硼酸盐缓冲液（可选） 3mol/L过滤后的硫氰酸钾 玻璃棉（polysciences) Sorvall离心机，SS-34型转子（或类似转子），4°C 0.45um滤器，过滤MAb上清 透析袋 1.5cmX10cm层析柱（如铺有玻璃棉的IOml注射器） 组分收集器 蠕动泵（可选） Ia适用于腹水：用玻璃棉去除腹水中脂类（见基本方案1，步骤la)，用10倍体积的PBS，pH8.0稀释腹水。 Ib.适用于MAb上清：于4°C将MAb上清以20OOOg离心后用0•45um滤器过滤。对于IgG1抗体，用透析（对pH8.0PBS)或者加入lmol/LNaOH的方法调整其PH到8.0。对于其他抗体亚类则调整到pH7.4。 2.将蛋白A交联琼脂糖凝胶CL-4B装入1.5cmX10cm层析柱中，连上组分收集器(CPI附录31)。于4°C或室温下用PBS，pH8.0平衡层析柱。上样（Iml至几升），当上样量大时，可用螭动泵或重力帮助上样。每毫升胶可结合约5mg小鼠IgG或8mg人IgG。用流式细胞仪（单元4.1、单元4.2)或ELISA(单元1.1)检测流出的未结合组分中的抗体活性，以判断上样量是否过量。 也可选择使用HiTrapA蛋白子页装柱（PharmaciaBiotech或Sigma)。 3.用数倍柱体积的PBS，pH8.0洗柱，一直洗到A28q到基线水平。用适当pH的0.lmol/L柠檬酸缓冲液（用lmol/LNaOH调整）洗脱目的蛋白：小鼠IgG1用pH6.5、IgG2a用pH4.5、IgG2b和IgG3用pH3.0。低pH会损伤抗体，因此洗脱前在收集管内按每毫升洗脱液加入5〇42mol/LTris-HCl缓冲液，用于立刻中和酸。 4.合并含目的蛋白的组分，将合并组分倒入透析袋，用含或不含有0.02%NaN3的ILPBS(pH7.3)透析，期间更换二次透析液，然后置于4°C保存。必要时可用SDSPAGE进行纯度鉴定。 5.层析柱可以先用1倍柱体积的过滤后的3mol/L硫氰酸钾清洗，然后再用数个柱体积的PBSpH7.3洗柱，最后保存于4°C。 |
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