含有目的基因真核表达 pEGFPC1载体的构建实验一转化
| 实验方法原理 | 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competentcells）。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞）。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | 重组质粒 试剂、试剂盒 | SOC液体培养基LB液体培养基JM109DH5αAmpKan 仪器、耗材 | LB平板 实验步骤 | 1. 100ul感受态细胞在冰中融化。 2. 分装2管，50ul/管。 3. 加入转化的DNAXul。 4. 冰中放置30min。 5. 42℃放置90sec。 6. 冰中放置2～3min。 7. 加入4倍体积的SOC液体培养基或LB液体培养基。 8. 37℃振荡培养1hrs。 9. 涂平板，37℃温箱培养12～16hrs。 注意事项 | 1. 加入DNA的量要小于10ng，DNA的量过高影响转化效率。 2. SOC培养基可以用LB培养基替代，但是转化率低于使用SOC培养基。 3. 热激温度42℃一定要准确，否则影响转化效率。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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