Overview:
AMPK (A1/B1/G3) is a member of the AMPK family which are heterotrimeric proteins consisting of an alpha catalytic subunit, and non-catalytic beta and gamma subunits. AMPKs are an important energy-sensing enzyme group in the cells that monitor energy status particularly in response to stress (1). AMPKs regulate fatty acid and cholesterol synthesis by regulating the key rate-limiting enzymes acetyl-CoA carboxylase and hydroxy beta-methylglutaryl-CoA reductase. The γ subunit is dominantly expressed in skeletal muscle where it may play a key role in the regulation of energy metabolism (2).
Gene Aliases:
Subunit A1:PRKAA1, MGC33776, MGC57364Subunit B1:PRKAB1, AMPK, HAMPKb, MGC17785Subunit G3:PRKAG3
Genbank Number:
NM_006251NM_006253NM_017431
References:
1.Viollet, B. et al: Physiological role of AMP-activated protein kinase (AMPK): insights from knockout mouse models. Biochem. Soc. Trans. 2003; 31; 216–219.2.Cheung, P. C. F. et al: Characterization of AMP-activated protein kinase gamma-subunit isoforms and their role in AMP binding. Biochem. J. 346: 659-669, 2000.
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没有序列识别的功能,他就是简单的催化相邻DNA链的5-P末端和3'-OH末端以磷酸二酯键结合的反应,需ATP作辅酶。 不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接,也催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。
反转录酶(Reversetranscripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。
在进行RT反应之前,应考虑以下几个方面:
1、RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA,高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中,要特别防止RNase的污染,同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA,B,C对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase,实验过程中经常更换新手套。
2、引物的选择
OligodT
选择OligodT时,要求RNA必须有PolyA,所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT,所以对RNA样品的质量要求较高,最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应,建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
随机引物
适合各种RNA的RT,尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。选择随机引物时,第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板,然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系,一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng,如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng,可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物产物的降低。
特异性引物
特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT,引物设计质量影响RT的结果,而且不同引物退火温度本来就不相同,所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择,一般不推荐。向左转|向右转
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