Overview:
FAK (Focal Adhesion Kinase ) is a non-receptor protein tyrosine kinase involved in signal transduction from integrin-enriched focal adhesion sites that mediate cell contact with the extracellular matrix. FAK-enhanced signals have been shown to mediate the survival of anchorage-dependent cells and are critical for efficient cell migration in response to growth factor receptor and integrin stimulation (1). Elevated expression of FAK in human tumors has been correlated with increased malignancy and invasiveness (2). Elevated FAK expression in anaplastic astrocytoma and glioblastoma tumor biopsy samples has been demonstrated.
Gene Aliases:
PTK2; FADK; FAK1; FRNK; pp125FAK
Genbank Number:
NM_153831
References:
1.Schaller, M D.: Biochemical signals and biological responses elicited by the focal adhesion kinase.Biochim Biophys Acta. 2001 Jul 25;1540(1):1-21.2.Gabarra-Niecko, V. et al: FAK regulates biological processes important for the pathogenesis of cancer. Cancer Metastasis Rev. 2003 Dec;22(4):359-74.
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没有序列识别的功能,他就是简单的催化相邻DNA链的5-P末端和3'-OH末端以磷酸二酯键结合的反应,需ATP作辅酶。 不仅可以催化粘性末端之间或平滑末端之间的DNA的连接,也催化DNA与RNA之间以及少数RNA之间的连接。
反转录酶(Reversetranscripatase)是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA(cDNA)的酶。哺乳类C型病毒的反转录酶和鼠类B型病毒的反转录酶都是一条多肽链。鸟类RNA病毒的反转录酶则由两上亚基结构。真核生物中也都分离出具有不同结构的反转录酶。
在进行RT反应之前,应考虑以下几个方面:
1、RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA,高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂,如EDTA或SDS。在提取RNA的过程中,要特别防止RNase的污染,同时在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链cDNA合成反应中,在缓冲液和还原剂(如DTT)存在的条件下加入,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性,从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNaseA,B,C对RNA的降解,并不能防止皮肤上的RNase,因此尽管使用了这些抑制剂,也要小心不要从手指上引入RNase,实验过程中经常更换新手套。
2、引物的选择
OligodT
选择OligodT时,要求RNA必须有PolyA,所以真核生物的mRNA都适用。适合长链甚至全长mRNA的RT,所以对RNA样品的质量要求较高,最好不要有明显的DNA污染、RNA降解和RNA断裂。假如想探索新的mRNA进行RT反应,建议推荐使用OligodT引物。使用OligodT引物要比随机引物和特异性引物的稳定性要好。
随机引物
适合各种RNA的RT,尤其适合模板丰度很低的情况(比如某个gene表达量很低)。选择随机引物时,第一链cDNA合成反应中就是以所有的RNA为模板,然后进行PCR反应时设计引物进行特异性扩增。同时要注意随机引物的量和总RNA量之间的关系,一般建议每5μg总RNA的随机引物的用量为50ng,如果每5μg总RNA的随机引物的用量超过250ng,可能会导致小片段产物(<500bp)的增加和长片断、全长产物产物的降低。
特异性引物
特异性引物只能用你设计引物时的下游引物做RT,引物设计质量影响RT的结果,而且不同引物退火温度本来就不相同,所以按照说明书按照一个温度做不是最佳选择,一般不推荐。向左转|向右转
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