α-卫星BAC转染HT1080细胞

材料

试剂
BACDNA

用Qiagen-tip500柱来提取无内毒素的BACDNA。然后用去内毒素水重悬浮BACDNA至浓度为0.5〜I.Oug/ul。

胎牛血清（FBS;Hyclone)

FuGENE-6(Roche)

商品化的DNA转移系统，包括转染试剂和电穿孔装置，都是根据小报道质粒（<5kb)的转染效率进行评估的。几乎没有关于传递高分子质量OlOOkb)DNA的效率的数据。在我们的实验中，以小DNA为基础做优化的平台不一定能很好地传递大分子BAC。我们测试了大部分可获得的知名的商品化的转染试剂；在我们的实验条件下，FuGENE-6试剂(Roche)在传递大分子DNA方面最有效而且可直接使用，毒性小。我们也对Lipofectamine2000(Invitr0gen)进行了实验，但是发现其方法繁琐，特别是处理多个转染时。

G418(50mg/ml;Mediatech)

HT1080纤维肉瘤细胞系

HT1080的培养液是含10%FBS的aMEM,补加50ug/ml的庆大霉素（GIBCO)。

基本培养基，Alpha(aMEM)，补加L-谷氨酸（如Cellgro或GIBC0)

曝呤霉素（l〇mg/ml;Invitrogen)

仪器

克隆环

标准组织培养设备，包括IOOmm培养皿及T-25烧瓶

方法

α-卫星BAC转染HT1080细胞

1.在转染前一天，用充足的HT1080细胞铺IOOmm组织培养皿，使第二天能够达到50%〜75%的覆盖率。每个转染的DNA需要至少铺两个培养皿。

2•在灭菌的I.5ml离心管中加人IOOfjJ无血清的ctMEM和4〜6ugDNA，每个培养皿一管。在其中慢慢加人15〜20fJFuGENE-6试剂，轻弹管壁混合。仔细观察溶液中是否存在白色沉淀。如果存在，用宽孔吸头慢慢打散。

在我们的实验条件下，当FuGENE-6:DNA(体积：质量）为3:2时转染大型BAC的效果最好，但是每个实验室都应该优化这个比值。需要小心的是，虽然超螺旋高分子质量的BAC对剪切破坏力彳I有耐受性，但是线性高分子质量DNA非常敏感。

3•室温下孵育FuGENE/DNA混合液30〜45min，其间轻弹管壁混勻。确定没有沉淀形成。

4.用宽孔吸头将FuGENE/DNA混合液轻轻加人HT1080细胞中，持续振摇培养皿使其均匀分布。

5.37℃孵育过夜

6.第二天，吸出培养皿中的培养液，加人合适的选择培养基（如含有3ug/ml嘌呤霉素或600ug/mlG418的培养基)。

G418也被称为新霉素或genetidn抗生素，不要与庆大霉素（gentamycin)混淆

7.在克隆形成后，至少挑25〜30个克隆做进一步分析。用克隆环将单个克隆转移到T-25烧瓶中。每3〜5d更换新的选择培养基。形成肉眼可见的克隆需要10〜14d。当转移单个克隆时，接种另外一个T-25或T-27板冰冻以长期储存。

用FISH法鉴定HAC重新形成

材料

试剂
乙酸

CEP-17cr卫星探针（Vysis)或同等非商品化探针

Colcemid溶液（lOjug/ml;KaryoMAX,GIBCO)

乙醇（70%、80%和100%;储存在一20℃

甲酿胺（ChemiconInternational)

H2O,Milli-Q处理（特级纯）

HT1080纤维肉瘤细胞，用BACDNA转染，在T-25烧瓶中长成单克隆（见方案1)

HybrisolVII(Qbiogene)

KCl(0.075mol/L)

将5.59gKCl溶解在IL双蒸水（ddHzO)中形成低渗溶液。用0.22Mm滤膜过滤除菌。用之前预热到37℃。

甲醇（100%).

甲醇/乙酸溶液（3:1v/v)

加入DAPI(Vectashield，Vector实验室）的Mounting培养液（防退色）

磷酸盐缓冲液（PBS)

20XSSC

将175.3gNaCl和88_2g柠檬酸钠溶解在800ml水中，用14mol/LHC1调节pH到7.0。加水至ILd充分溶解高压灭菌。用前稀释。

胰岛素（0.05%溶解液)

仪器

装备相差镜头的Benchtop型显微镜

医用离心机

Coplin细胞培养用广口瓶

盖片（1号，各种大小；Fisherfinest，FisherScientific)

荧光显微镜

湿度调节器

显微载玻片（FisherScientific12-550-43)

Pasteur吸管（9in，玻璃；Fisher13-678-20D)

标准组织培养装置，包括15ml圆管和T-25烧瓶

水浴，预热到37°C

方法

用于染色体扩散的克隆细胞系的准备

1.当T-25烧瓶中的HT1080克隆（见方案1)细胞接近长满时，向每个烧瓶中加人I6.SfJcolcemid溶液。在37°C孵育40〜60min。观察是否有圆形的分裂期细胞。

2.在37°C的水浴中预热50ml0.075mol/LKC1。每个细胞株标记一个15ml圆形管备用。

3.将表面细胞转移至圆形管中。用PBS清洗烧瓶吸去多余液体。

4.向每个T-25烧瓶中加入Iml胰岛素溶液。37°C孵育至细胞分离。将表面细胞重新加人烧瓶中，用力吹打以悬浮细胞，将悬浮细胞转移到圆形管中。

5.室温下用医用离心机1500〜2000r/min离心圆形管5〜lOmin。

6•吸去细胞沉积物上的水。在每个管中边摇晃边加入ioml〇.〇75mol/LKC1。室温下盖上组织培养盖孵育12min。按步骤5中的条件离心。在我们的实验条件下，孵育HT1080的最理想时间是I2min。也可以做一些优化。

7•吸去细胞沉积物上的水。轻弹管壁重悬浮细胞以避免细胞丛生。

8.逐滴加人lml3:l(V/V)的甲醇/乙酸溶液固定细胞。再另外加人4ml甲醇/乙酸达到5ml。颠倒圆形管。

9.按步骤5中的条件离心。在染色体扩散之前，可在_2〇-C的甲醇/乙酸溶液中保存细胞沉淀物。

准备用于FISH的染色体扩散

众所周知，用于FISH的高质量的染色体扩散易受实验室环境因素和操作者的经验的影响。此过程的很多方面都可以更多的说是一项「艺术」，不同的实验室可能会应用不同的实验方案。下面的实验方案只是初步的框架，每个实验室可以根据自身环境做调整和优化。

在一个小密闭，且湿度可以控制的房间里进行染色体「降落」试验。比如，可以在降落步骤进行前几小时打开2〜3个水浴和湿度调节器。

10.把固定的细胞从一20°C中取出（见步骤9)。室温下用医用离心机1000〜2000r/min离心5〜IOmin沉积细胞。吸去多余的固定液，轻弹管壁重悬浮细胞。

11.配置新鲜的固定液（30ml甲醇+IOml乙酸），放置到降落室中。在放满1〇〇%甲醇的Coplin广口瓶中放置几个新的显微载片。

12.用Pasteur玻璃吸管加人足够的新鲜固定液重悬浮细胞，使溶液轻微混浊，但是仍可以看清吸管。

13.擦干一个显微载片，用力吹向载片至少3次使其潮湿；在载片的降落面形成可见的雾化状态。把载片拿到与腰齐平，玻璃吸管与肩水平。确保细胞在充分悬浮状态(一定不能成团!）在载片上滴1〜2滴细胞悬浮液。

14.用力吹向载片表面至少3次使其潮湿。在湿度调节器的气流上放置载片至少10s。再向降落面吹3次保持潮湿状态。垂直晾干。如果需要可用无棉纸擦拭载片背面。不要让载片太靠近湿度调节器。只要维持其潮湿状态即可，不能形成液滴。

15.载片干燥后，用相差显微镜和20X目镜观察扩散状态。染色体应该是干净的，呈暗色均一状态，有很好的延展状态，但是可清晰看出是由一个细胞裂解而形成的。如果染色体的扩散状态不佳，可以尝试在固定液中直接加入乙酸再重复。或者尝试从更高高度滴落，把甲醇：乙酸调整为1:1，升高或者降低环境湿度。

16.向残留的细胞中加人IOml新鲜固定液，用医用离心机1000〜200〇r/min离心5〜l〇min。用之前可以在一20°C固定液中储存细胞。

17•把载玻片放在工作台或真空柜中过夜彻底干燥。在杂交之前，载玻片需在干燥器中储存1〜14d。

α-卫星探针杂交染色体扩散

18•在37°C水浴中，把扩散干燥好的载玻片放人2XSSC中孵育30〜90min。

19.将预冷的70%乙醇（在一20°C储存）装入Copliii广口瓶中拿到水浴前，在一2〇°C执行如下系列乙醇洗涤使染色体扩散脱水。

a.70%乙醇洗2min。

b.80%乙醇洗2min。

c.100%乙醇洗2min。

d•把载玻片从乙醇液中取出，一次一片。用无棉纸吸干背部水分。

e.放置在工作台上干燥lOmin。

20.72°C在70%甲酰胺/2XSSC(PH7.0)溶液中洗载玻片2min变性样品。重复步骤19的乙醇洗涤过程。将预冷的70%乙醇装人Coplin广口瓶中拿到72°C水浴前。放置在工作台上干燥IOmin或过夜。

21.在20ulHybrisolVII中加人0•5/nlVysisCEP-17探针（或同等的非商品化探针），为每个预备杂交的载玻片准备一管。72°C变性5miri后放置在冰上。

22.将变性的探针直接加到每个载玻片上，盖上盖玻片。不要用橡皮泥或者指甲油封闭。在潮湿的盒子中孵育过夜（如放入湿的纸手帕的塑料盒；用两个IOml吸管作为载玻片的支架)。

23.第二天，按如下步骤洗涤载玻片。在第一步洗涤中除去盖玻片。

a.42°C在65%甲酰胺/2XSSC(pH7.0)中清洗载片8min(更高层次的cr卫星序列要进行更严格的清洗）

b•用新鲜的65%甲酰胺/2XSSC(pH7.0)重复清洗。

c.37°C在2XSSC中清洗8min。

d•用Coplin光口瓶装满Milli-Q处理水冲洗载玻片。甩掉多余的水分，用无棉纸吸干背部水分。

24•在潮湿的载玻片上加上20〜40ulDAPI/防脱色mounting培养液（Vectashield)。用P20吸管头轻轻将1号22X50盖玻片放置在每个载片上。轻轻地用无棉纸吸干盖片表面多余的mounting培养基。用指甲油封闭盖片边缘。在荧光显微镜观察之前,把玻片在室温下放置在暗玻片盒里至少2h。4°C长期储存。

确定HAC上的着丝粒重新形成

材料

试剂

Colcemid溶液（lOfxg/ml;KaryoMAX，GIBCO)

之前预热到37°C。

甲醇/乙酸溶液（3:IV/V)

加入DAPI(Vectashield,Vector实验室）的Mounting培养液

磷酸盐缓冲液（PBS)

PBS/0.2%TritonX-100

—抗（抗CENP-A鼠单克隆抗体；StressgenBiotechnologies)

二抗（如抗鼠IgG/若丹明或者突光素；JacksonImmunoresearch)

20XSSC

将175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠溶解在800ml水中，用14mol/LHC1调节pH到7.0。加水至1L。充分溶解高压灭菌。用前稀释。

仪器

装备相差镜头的Benchtop型显微镜

医用离心机

荧光显微镜

ShandonCytospin4cytocentrifuge(ThermoElectron)

ShandonDoubleCytofunnels(ThermoElectron5991039)

ShandonDoubleCytoslide，包被的（ThermoElectron5991055)

标准组织培养装置，包括15ml圆管和T-25烧瓶
方法

1•在T-25培养瓶中培养挑好的克隆细胞系。长到80%〜90%满后，每瓶加人25ulColmnid溶液。在37°C孵育大约45min。用显微镜观察圆形，分裂期细胞的产生。

2•在Colcemid孵育过后，把每个培养瓶中的大部分培养液转移到15ml圆形管中。在工作台上用力敲打T-25培养瓶15〜20次。用圆形管中的培养液冲洗新脱离的细胞，把培养液（和细胞）转移回15ml圆形管中。

3.用医用离心机200〇r/min4°C离心细胞lOmin。吸走培养液，轻弹管壁使细胞在残余培养液中悬浮。

4.边搅动边向每管细胞中逐滴加入Iml预热（37°C)的0.075mol/LKCl。另外再加人4ml预热的0•075mol/LKC1。将剩余的0•075mol/LKCl放置在冰上，37°C孵育细
胞12min。

5•装配标记ShandonDoubleCytofunnels。用相应的为Cytospin设计的包被显微载片，每片上有两个点进行细胞沉积。

6.室温用医用离心机l〇〇〇r/min离心细胞5min。轻轻倒出0.075mol/LKCl。用3ml冰上预冷的〇•〇75mol/LKCl重悬浮细胞。..用转移吸管用力吹打确保全部悬浮。

7•每个Cytofunnel加人250〜300ul细胞悬液。室温下200r/min离心lOmin。

8.从Cytospin上移走载片，干燥lOmin。但不要完全干燥。将载片在室温下PBS/0•2%TritonX-100中孵育6min。

9.用相差显微镜和20X目镜观察染色体扩散状态。
染色体颜色应为亮色，与背景差别较小，所以有些难于观察到。如果可以看到几个扩散,就可以断定有很多未看到的扩散存在。如果扩散很密集，用更多的〇.〇75mol/LKCl稀释细胞重复Cytospin步骤。

10.室温下用4%甲醛/PBS/0.2%TritonX-100固定细胞lOmin。

11•用PBS清洗载片5min，立即用一抗（抗CENP-A鼠单克隆抗体，用PBS稀释）赙育。在每个载片上盖上盖片（不要封闭），37°C在潮湿的柜中解育过夜。抗体的稀释浓度可以为1/50〜1/500。

12.用PBS洗载片两次，每次5min。

13.每张载片加入IOOmI用PBSl:200稀释的二抗（如抗鼠IgG与FITC/TRITC共价结合）。盖上未封闭的盖片，在潮湿的柜中37°C孵育lh。

14•用PBS洗载片两次，每次5min。

15.室温下用4%甲醛/PBS/0.2%TritonX-100固定样品IOmin(见步骤1〇)。

16.用水洗载片两次，每次5min。

17.室温下用甲醇/乙酸溶液（3:IVAO固定样品15min。室温下在暗处干燥载片5min。

18.85°C在70%甲酰胺/2XSSC中变性样品Wmin11

19.在一20°C执行如下系列乙醇洗涤脱水样品。

a.70%乙醇洗2min。

b.80%乙醇洗2min。

c.100%乙醇洗2min。

d.室温下在暗处干燥载片。

20.当步骤19中80%乙醇脱水步骤开始时，85°C孵育FISH探针5min变性（见方案4)。使用前在37℃储存。

21.每个细胞圈加7〜IOul探针，盖上22mmX22mm正方形盖片（不要封闭）。在37°C潮湿的柜子中（如放人湿的纸手帕的塑料盒；用两个IOml吸管哦作为载玻片的支架）孵育过夜。

22.42°C用50%甲酰胺/2XSSC洗载片两次，每次10min。然后42°C在2XSSC洗载片IOmin0

23.擦干每张载片的背面。每张载片加3滴8ulVectashield，盖上1号24X50盖片。用指甲油封闭盖片边缘。在荧光显微镜观察之前，可在4°C储存。

FISH探针的准备

材料

试刻
BACDNA模板

用Tris-EDTA(lOmmol/LTris、lmmol/LEDTA,pH8.5)缓冲液准备浓度为〇.2ug/ul到Iug/ul的电泳级BAC载体骨架DNA溶液。

COT-1DNA(Invitrogen)

dNTP混合液（〇.lmmol/L)

混合10/J〇.3mmol/LdATP、0.3mmol/LdCTP和0.3mmol/LdGTP。

dTTP(0.lmmol/L)

在20ul无核酸酶的水中加人IOul0.3mmol/LdTTP。

dUTP(0•2mmol/L;SpectrumGreen，SpectrumOrange，或SpectrumRed;Vysis)

在40ul无核酸酶的水中加人10M1〇•3mmol/LdUTP。

乙醇（100%)

H2O(无核酸酶）

人胎盘DNA(Sigma-Aldrich)

HybrisolVII(Qbigene)

nickTranslationKit(Vysis)

乙酸钠（3mol/L，pH5.2)

仪器

琼脂糖凝胶电泳标准器材，包括分子质量标记

方法

标记探针

1.把一个离心管放置在冰上冷却。

2.已下面列表的顺序在其中加人如下组分。在加酶之前轻微离心涡旋。

17.5〜xul无核酸酶水

Xul提出的DNA(Ipg)

2.5uldUTP(0.2mmol/LSpectrumGreen，Spectrum
Orange或SpectrumRed)

5uldTTP(0.lmmol/L)

IOuldNTP混合液

5ulIOXnicktranslation缓冲液

10ulnicktranslation酶

总体积50ul

3.轻微离心涡旋离心管。15°C孵育8〜16h。

4•在70°C水浴中加热IOmin终止反应。冰上冷却。

随着酶量和孵育时间的延长，小的探针片段也随之增加。要想获得小的探针片段，可以应用如下条件（以片段大小逐渐减少为序）：5ul酶混合物+8h孵育，5ul酶混合物+I6h孵育，IOftI酶混合物+8h孵育以及IOul酶混合物+16h孵育。调整无核酸酶水的量以控制反
应总体积在50ul。

5•点样10ul用2%的琼脂糖凝胶电泳检查探针的大小。大部分的探针应该在3〇〇bp附近。

沉淀探针

6.把5ul(约IOOng探针）的切口平移反应混合液加人离心管。加人1ugCOT-1DNA、2ug人胎盘DNA和4ul纯水。加入1.2ul(0.1体积）3mol/L乙酸钠（pH5.2)，再加入30ul(2.5体积）100%乙醇沉淀DNA。轻微涡旋在干冰上放置15min。

7.4°C，12000r/min离心DNA30min。

8.移去上清，室温下真空干燥沉淀10〜15min。沉淀的探针可以以沉积状态储存在-20℃。

9.在IOulHybrisolVII中重悬浮沉淀。在使用之前，在85°C水浴中加热5min变性(见方案3,步骤20)。重悬浮的探针可以在4°C储存少于2周或一20°C未知时长。