实验方法原理 | 如果将微生物细胞裂解,使其拟核(即染色体DNA)被抽提出来,通过溴化乙淀(ethidiumbromide,简称EB)染色并进行琼脂糖凝胶电泳,便可观察到释放到细胞外的染色体DNA。EB是一种扁平分子染料。可特异性插入DNA碱基对之间,在紫外线照射下,使DNA呈现荧光,因而可观察到凝胶中的染色体DNA,由于在提取过程中大分子染色体DNA的随机断裂,所以经凝胶电泳后形成的是一条不整齐的浓的荧光带。 用EB染色法进行的体外观察染色体DNA也分两步进行: 1.将细胞裂解后抽提染色体DNA; 2.通过含有EB的琼脂糖凝胶电泳在紫外光下观察染色体DNA荧光带。 | ||||||||||
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实验材料 | 大肠杆菌 试剂、试剂盒 | TE缓冲液10%SDS蛋白酶K(20mgml)5molLNaClCTABNaCI酚氯仿异戊酵(25:24:1)异丙酵70%乙醇溴酚蓝加样缓冲液TAE电泳缓冲液 仪器、耗材 | 台式高速离心机5ml塑料离心管真空干燥器 实验步骤 | 1.取4.5ml大肠杆菌过夜培养液于5ml塑料离心管中,12000r/min离心1~2min,弃上清。 2.将细胞沉淀悬浮于1.7mlTE缓冲液中,加入10%SDS90μl和20mg/ml的蛋白酶K9μl混匀,37℃保湿1h。 3.加入5mol/LNaCl300μl,充分混匀,再加入240μlCTAB/NaCl,混匀,置65℃水浴10min。 4.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀,12000r/min离心5min。 5.将上清水相转入另一洁净的塑料离心管中,加0.6倍体积的异丙醇使DNA沉淀下来。 6.快速离心数秒钟,弃上清,用70%的乙醇淋洗DNA2次,将DNA沉淀经真空干燥后溶于300μlTE缓冲液中。 用此法获得的染色体DNA可用于限制性酶切等分子生物学操作。 7.取少量(约3~5μl)提取的DNA样品(其余置于-20℃保存),加入3μl溴酚蓝加样缓冲液,混匀后上样进行琼脂糖凝胶电泳1~2h。琼脂糖中加有EB,在电泳过程中,EB将插入DNA分子中。 8.戴上一次性塑料手套(EB是强诱变剂)将凝胶取出置于紫外分析仪上观察染色体DNA荧光带。 注意事项 | 必须通过一块普通玻璃或戴上防护眼镜进行现察,以免损伤眼晴。 其他 | |