定量SDS凝胶染色与扫描
| 试剂、试剂盒 | 考马斯亮蓝（CBB)染色液脱色液 仪器、耗材 | SDS-PAGE电泳装置凝胶扫描装置 实验步骤 | 设备 SDS-PAGE电泳装置 凝胶扫描装置 试剂 考马斯亮蓝（CBB)染色液 脱色液 (配方，见“试剂的配制”，PP.184~189) 操作程序 1)小心地在SDS凝胶泳道上加一组按量递增为序的蛋白质样品，再按同样顺序加一组纯蛋白质样品作为定量的标准。按常规进行电泳（见附录5)。 2)从电泳装置取下凝胶，置于脱色液中漂洗1min以脱去部分SDS，再将它浸泡在CBB染色液中，于20°C缓慢摇动（如在脱色摇床上）。0.75-mm厚的凝胶需浸泡lh,1.5-mm厚的凝胶约需4h。 3)倾出CBB染色液，将凝胶浸泡在脱色液中，缓慢摇动1~4h,视凝胶厚度而定(用海绵或Kimwipe纸巾吸收游离的染料)。当大部分染料由凝胶扩散出来后,从容器中取出吸收物，于脱色液中加入CBB染色液，使其A650nm值达0.1(浅蓝色)。当时，CBB的浓度大于它与蛋白质的平均结合系数。凝胶置于此稀染色液中平衡过夜，并保存于其中直至扫描测定。 4)在650nm波长下，扫描经染色和脱色的凝胶，测定各蛋白带中结合染料的量。 5)对每条带，以结合染料量对其加样量作图，比较所得直线与标准曲线的斜率,计算各样品中目的蛋白的浓度。 6)对原材料或纯化各步祥品的凝胶扫描全程进行积分，计算σ32带中的蛋白质占总蛋白量的比例。 注：此值是纯度的最大估计值。通常，在检测极限下还有许多条带，如将它们加在一起时就不能忽略了。多数研究者常高估他们的蛋白质制备物的纯度。 |
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发布于 ： 2018-08-10
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