一、探针

已经标记好的商品探针以混合形式溶解在杂交液中。

二、从组织中制备染色体

1.在组织培养用的超净工作台中进行无菌操作，在无菌培养皿中，用刀片将组织切碎成细小的块。

2.将细碎的组织块转入有足够培养基的、具有通气孔的组织培养瓶中；培养基要盖过平面放置的培养瓶底（通常10~15mL)。

3.将培养瓶放入CO2培养箱中，静置培养24h。

4.光镜下观察其生长状态。

5.当达到要求的生长状态或培养时间时，向培养瓶中加入秋水仙胺至终浓度l(ug/mL，在CO2培养箱中继续培养2~3h(见注释1)。

6.将培养基和悬浮的组织或细胞一起转移到15mL锥形底离心管（见注释2)。对于非贴壁细胞，继续步骤10。

7.向培养瓶中加入IOmL柠檬酸盐溶液，漂洗贴壁的细胞，弃去柠檬酸盐溶液。

8.向培养瓶中加入10mL1X胰酶。观察贴壁细胞自培养瓶壁上脱离，轻轻吹打，将细胞自瓶壁上吹打下来，转移到15mL锥形离心管中。

9.向含有贴壁细胞的15mL锥形离心管内加入5mL新鲜配置的培基（见注释3)。

10.1500g离心10min收集细胞。

11.倒掉或吸出上清，只留下0.5~1mL溶液。用手指轻轻敲打管底，打散细胞团。

12.加人预热的0.075mol/LKCl溶液，开始的1mL逐滴加入，滴加中间混匀（见注释4);然后将剩下的14mL加入并轻轻颠倒混匀，37°C放置10min。

13.加入5滴比例为3:1的甲醇：冰乙酸，混匀（见注释5)。

14.1500g离心10min。

15.倒掉或吸出上清，打散细胞团（见注释6)。加入新鲜配置的甲醇：冰乙酸（3:1)固定液15mL，用上述的方法开始的ImL逐滴加入，滴加中间混匀；然后加入剩余的14mL固定液，并轻轻颠倒混勻。

16.1500g，离心.10min。

17.重复步骤15的固定。然而，最初的1mL不需要逐滴加人。离心，重复固定3次。

18.细胞悬液可以以固定液中细胞团的状态-20°C保存。

19.为了进行染色体标本制备，倒掉固定液，重悬细胞团块，加入适量的新鲜固定液使悬液轻度浑浊。

20.用200ul的枪，吸取100ul悬液，滴到干净的载玻片上（见注释7)，室温下晾干并储存片子。滴好的片子至少自然老化2d或37°C过夜老化。

三、染色体标本预处理和变性

1.染色体标本至少自然老化2d或用前37°C过夜。

2.染色体标本在系列乙醇（70%、80%和95%)中分别脱水5min，晾干。

3.加入15~20uL的10%胃蛋白酶储存液（见注释8)到50mL预热的O.Olmol/LHCl中，将染色体标本在37°C染色缸中温育5min(见注释9)。同时，准备一缸70%甲酰胺/2XSSC溶液并放入75°C水浴中预热。

4.取出标本，在室温下的1XPBS中漂洗5min。

5.在1XPBS/MgCl2室温温育5min。

6.向50mLlXPBS/MgCl2中加入1.5mL37%甲醛，在室温下的该溶液中温育标本10min(见注释11)。

7.在室温中的1XPBS中漂洗5min。

8.按步骤2中所述方法再次进行系列乙醇脱水。

9.晾干片子后，检查甲酰胺溶液的温度是否达到75°C(见注释11);将染色体标本在75°C甲酰胺溶液中变性2min。

10.迅速将标本转移到冰冷的70%乙醇中并用系列乙醇脱水（见注释12)后晾干。

四、探针变性

1.对于每张标本，22mmX22mm盖玻片的范围内需要用10uL探针；如果该区域大于此范围，增加探针的使用量。取适量的探针到一个Eppendorf管中。

2.在水浴锅或PCR仪上75°C热变性探针10min。

3.将探针于37°C水浴中预复性lh。

五、杂交

1.从37°C中取出预复性的探针，小心的加到变性的中期染色体标本上。因为探针既有直接标记又有间接标记，应迅速操作并避免长时间暴露在光线条件下。

2.小心的盖上盖玻片，注意不要产生气泡。如果出现气泡，轻按盖玻片，将气泡挤出。

3.用橡皮泥封好盖玻片边缘。

4.放入杂交盒（见注释13)，并放入塑料袋中（可选择的），在37°C条件下杂交48h。

六、杂交后洗脱和检测

1.在45°C水浴中预热所有的溶液。

2.从杂交盒中取出片子，小心除去橡皮泥。盖玻片也许随橡皮泥一块揭去或仍留在片子上。如果盖玻片留在片子上，直接将标本放入第一缸洗脱液。

3.在50%甲酰胺/2XSSC中洗3次，每次5min。在第一次洗脱时盖玻片应滑掉。轻轻振荡染色缸几秒钟（见注释14)。

4.在1XSSC中洗片3次，每次5min并轻轻振荡。

5.标本浸在0.01%Tween-20/4XSSC中，取出标本，甩掉多余的液体，但保持片子表面湿润。

6.取30~40uLSKY试剂盒（AppliedSpectralImaging提供）的瓶2中的封闭液加到标本上，盖上盖玻片。

7.将标本放回杂交盒，37°C温育30min。

8.小心移开盖玻片，取30~40pLSKY试剂盒（AppliedSpectralImaging提供）的瓶3中的检测溶液加到片子上，并盖上盖玻片。

9.将标本放回杂交盒，37°C温育约30minD

10.小心移开盖玻片，在0.01%Tween-20/4XSSC中洗3次，每次5min。轻轻振荡。

11.甩掉多余的液体，取30~40ulSKY试剂盒（AppliedSpectralImaging提供）的瓶4中的检测溶液加到标本上，盖上盖玻片。

12.将标本放回杂交盒，37°C温育30min。

13.小心移开盖玻片，在0.01%Tween-20/4XSSC中洗片3次，每次5min。轻轻振荡。

14.在室温下的2XSSC中漂洗片子。

15.用15~20斗瓶5中的DAPI/抗淬灭剂封片，盖上盖玻片，避免产生气泡。

16.可以进行阅片。标本应在一20°C保存。

七、图像抓取

1.尽可能及时的进行图像抓取和分析。尽管荧光素在一20°C并尽可能少的光线条件下能保存几个月，但随着时间的延长，信号强度会减弱（见注释17~20)。

2.在实验室安装系统时进行用该系统抓取图像和分析的培训。

八、用SKY探针与曾G显带过的中期染色体标本的杂交：标本预处理

1.在室温下的二甲苯中洗2次，每次5min，除去G带标本上残留的镜油(见注释15)。

2.将标本浸在甲醇中10~15min褪色，或直到标本完全褪色。

3.标本褪色后，进行系列乙醇再水合：95%、80%和70%乙醇，每次5min，瞭干。

4.继续从本章3.3的步骤5开始。

5.如果标本曾显带过，在70%甲酰胺/2XSSC中变性时间需调整以反映标本特性（见注释16和表1)。保守变性时间为40s。