1.制备细胞先制备好单层细胞培养物，在低倍显微镜下观察，挑选生长良好的细胞，按「传代细胞培养」法进行，将细胞单层洗涤、消化、计数。配制所需浓度的细胞悬液，细胞数目可因细胞种类而异，通常为20万-30万/ml。预先将微量细胞培养板设计好，标记；用微量加样器将细胞悬液加人微孔中，每孔200µl。

2.孵育细胞将装有细胞悬液的微孔板置于5%CO₂培养箱中，37℃培养直至细胞生长成良好的单层。

3.接种病毒用含2%小牛血清的Eagle"s维持液作为稀释液，将待测病毒作连续10倍稀释，如10^-1、10^-2、10^-3……10^-10等。将培养板中的培养液全部倾弃，用微量加样器把每个稀释度的病毒液依次、对号加入各个微孔，每孔100µl,每个稀释度加4孔，同时设细胞对照孔4孔，不加病毒，只加稀释液，置于37℃5%CO₂培养箱中培养。

（二）观察结果

于培养后的不同时间，如18h、24h、36h等，在倒置显微镜下观察细胞病变情况。1.细胞病变程度表示法通观整个「单层区」，权衡总的情况，以下列符号表示其病变程度：

-：表示无细胞病变。

+：表示1%~25%的细胞有病变。

++:表示26%~50%的细胞有病变。

+++：表示51%~75%的细胞有病变。

++++:表示76%~100%的细胞有病变。

2.记录结果病毒引起细胞病变效应的滴度以半数细胞培养感染量(50%cellcultureinfectiousdose,CCID₅₀)表示，即凡能使50%(半数）细胞出现病变的最高病毒稀释度，即为50%感染单位，简称CCID₅₀。有时也称其为半数组织培养感染量(50%tissuecultureinfectiousdose,TCID₅₀)。细胞病变效应出现的时间，不同病毒不完全一样，以感染细胞的病变不再发展，而对照细胞仍完好为准。

（一）CCID₅₀的计算

L用Reed-Muench法计算CCID₅₀

2.Karber法计算CCID₅₀

公式：lgCCID₅₀<或LD₅₀、ID₅₀)=L+d(S-0.5)

L—病毒的最低稀释倍数的对数；

d—稀释系数，即组距；

s---细胞病变比值的和（不包括最低稀释度细胞病变的比值）。

（二）ID₅₀和LD₅₀的计算

ID₅₀的计算与CCID₅₀完全相同，但依接种动物或胚胎是否受感染而判定，感染与否的判定标准如家兔在接种猪瘟病毒之热反应，鸡胚胎接种新城疫病毒后血球凝集。

LD₅₀计算方法与前两者完全相同，只是判定标准是以接种动物或胚胎是否死亡判定的。

（三）CCID₅₀与PFUs的换算

如果用同一细胞系做CCID₅₀试验和空斑形成单位(PFUs)试验，1ml病毒液将会产生的PFUs约相当于CCID₅₀滴度的一半。此时的感染量为至少在单层细胞上出现1个病毒空斑，而实际测量时，在单层细胞上可能出现1个以上的病毒空斑，因此需要按实际测量的空斑数计算。若按数学公式推导，预期的PFUs将会超过CCID₅₀滴度的一半。因为在CCID₅₀测量时，阴性代表在单层细胞上出现的空斑数为0,阳性代表在单层细胞上出现1个或1个以上的空斑。

按照泊松分布的公式P(O)=e（-m）,P(O)代表阴性孔数的比例，m代表PFUs/ml,因为任何CCID₅₀的P(O)=0.5因此，e(-m)=0.5,m=—ln0.5≈0.7。所以0.7乘以CCID₅₀的滴度即为预计的PFUs。