第1天

显微针的制备四分体解剖针可以通过手工拉制细玻璃丝或使用「技术和方案23,制备四分体解剖针」中描述的光学纤维玻璃丝来制备。将会演示针的准备过程并且提供给你一些必需品，以便你可以自己制备。针和固定器也可通过商业途径获得。

用消解酶处理在开始本课程前3天，指导教师会把二倍体菌株3-3接到孢子形成培养基上。在显微镜下观察形成孢子的培养物，并辨别未形成孢子的细胞以及四孢子子囊，以及少于四个孢子的子囊。每个学生将安排3天时间用4个活的孢子来制备20个解剖了的四分体，并用消解酶的方法来处理细胞。在「技术和方案22，四分体解剖」中描述了四分体的显微操作。

第3天

完成四分体的解剖。

第5天

每个学生必须用无菌扁平牙签和模板（附录D，平板划线模板）制备两块上面有4个活孢子菌落（每块板有10个四分体）的母板。每个平板上包括两个亲本对照菌株。

在30°C下过夜培养。

第6天

影印平板上的四分体到测试培养基影印母板到以下培养基上：YPD、SC-leu、SC-arg、SC-ade、SC-trp、YPD+cyh和6个以上的YPD平板（在开始前见下面的提示）。第一块YPD平板作为新鲜的母板留作后用。其余的YPD平板用于将孢子菌落与测试菌株的交配。所有平板在30°C下培养。

提示：从一块原平板做12次影印是一个大的工作量。在6次影印后，在影印模具上放一块新的绒垫，并用母板做新的影印。因为用了两次母板，第一次用绒垫要轻些影印，以便第二次影印时在原板上还保留有细胞。每次影印后要检查一下，应该能看到其相应于母板上排列方式的轻微的细胞沉淀。如果没有看到，要再试一次。另一种方法:

孢子菌落接种到含有无菌水的一个微量滴定盘中，然后用多头接种器，即多头转接技术(froggingtechnique)将这些细胞转移到不同测试板上。在^J和的菌株间能发生交叉给养（cross-feeding),因此轻微地影印到SC-trp板上是重要的。

交配型和等位基因测试菌的准备在5ml的YPD培养基中培养测试菌株3-4到3-13。或者，在YPD培养基上制备大块的测试菌株的菌斑。30°C下过夜培养。

第7天

交配型测试菌苔的准备使用其中一种方法。

a.离心5ml的3-4和3-5菌株培养物（桌面离心机2000r/min，5min)。在一个无菌的旋盖试管中用4mlYPD重悬浮菌体。加0.15ml无菌水和0.15ml重悬的菌株3-4的培养物到两块SD平板（剩余细胞储备在4°C)。用无菌棒将菌体涂匀，水平放置平板，使平板晾干。同样处理菌株3-5。

b.用收集棒从YPD平板上刮取菌株3-4的一个新鲜菌斑，重悬于4ml的YPD液体培养基中。过夜培养使之细胞浓度达到过饱和。涂0.2ml菌液到两块SD平板上。同样处理菌株3-5。液体挥干后，影印平板到菌苔上。

等位基因和互补测试菌苔的准备除MATa和MATa型测试菌株被置于同一块平板外，这些菌苔的准备与在「交配型菌苔」中的方法同样。准备4种类型的测试菌苔，并且每种准备两块。在SC-ura-his平板上涂开arg4测试菌苔（菌株3-6与3-7混合，菌株3-8与3-9混合）。对于Trp互补菌苔（菌株3-10与3-11混合，菌株3-12与3-13混合），将细胞涂到SC-trp平板上。在影印平板到菌苔上以前，让液体变干。

复制平板到测试菌苔用6个前一天制备的四分体的YPD影印物作源影印到6个测试菌苔上。对于每个测试菌苔，均用一个新的绒垫，把YPD平板印在绒垫上，然后将测试菌苔平板印在绒垫上，以此来转移四分体到测试菌苔上。测试平板在30°C下培养过夜。

第9天

影印SC-um-his平板上的等位基因测试菌苔到SC-arg平板上并且冷藏。在当日结束时，由实验室助理收集平板，用STRATAGENE公司的Stmtalmker7500|uJ的紫外线灯（254nm)照射。

分析交配型测试平板和Trp互补平板的生长情况。由于tr和缺陷菌株能与缺陷菌株共生，需要影印SC-trp平板到一块新的SC-trp平板上并在第二天分析。

第10/11天

分析arg4等位基因测试平板及Trp互补平板。

第11天

确定在杂交中每种对标记发生分离后的PD、NPD和T型四分体的数量。在本实验末尾的记录单上记录PD/NPD/T型资料。此外，记录每个标记的第二次分裂分离的频率。通过搜寻在酵母基因组数据库（SGD;http://www.pathway,yeastgenome.org/)中的关于每个基因图谱的信息来确定每个基因与着丝粒间的距离。用收集的资料计算：

1)每个分析基因与所有其他分析基因间的图谱距离2)每个基因与它的着丝粒间距离（如何与SGD提供的信息相比较?）3)所有我们研究的等位基因的基因转换频率（3:1或1:3分离）第14天准备提交资料