为转导靶向构建RGD-修饰纤毛的Ad载体

材料

为纤毛修饰构建穿梭质粒载体

1.从回收质粒分离抗-氨苄青霉素的纤毛区域片段。

a.EcoRI酶切10吨抗-氨苄青霉素的PAdEasy-I质粒4h。

b.1%琼脂糖胶回收9.6kbDNA片段。

c.连接环化。

合成的新质粒（pFiberdE3-Amp)具备完整的纤毛区域。

2•分离抗-卡那霉素抗性基因。

a.EcoRI酶切IOfigpABS.4。

b•用Klenow片段补齐酶切末端。

c.用连接酶环化重组的质粒（pABS.4AEcoRI)。

d•用EcoRI酶切PABS.4AEcoRI。

e.用Klenow片段补齐BawxHI位点。

f•用&出1酶切PABS.4AEcoRI。

合成的I.3kb片段包含卡那抗性基因和末端两个SttaI位点。

3_将卡那抗性基因插人抗-氨苄纤毛载体。

a.用M/eT[酶切pFiber-dE3-Amp。

b•用Klenow片段补齐Mfe1[位点。

c•用BsiBI酶切pFiber-dE3-Amp。

d•将I.3kb的平末端的片段插人pFiber-dE3-Amp的M/el-BsiBI位点。

合成的载体（pFiber-dE3)包括纤毛区域和氨苄抗性基因与卡那抗性基因。

构建突变的纤毛knob基因（图3)

4.PCR制备互补的RGI>4C片段。
a•加人30umol/L的primerA(上游引物）和primerB(下游引物）到500ng的pFiber-dE3中，制备撤eI-(RGI>4C)。

b•加人30umol/L的primerC(上游引物）和primerD(下游引物）到500ng的pFiber-dE3中，制备（RGD——4C)-M/eI片段。

c•按如下条件设置PCR:94°C变性lOmin，35个循环（94°C,30s，50°C，30s,72℃,60s),72°C,IOmin

d.用2%的琼脂糖胶回收NAeI-(RGI>4C)(1199bp)和（RG]>4C)-M/eI(180bp)。

5.制备突变的纤毛knob序列。

a.混合MieI-(RGIMC)和（RGI>4C)-M/eI两个片段。

b.不再加人引物PCR扩增500ng的混合物，条件如下：94。(：变性4min30s,10个循环（94°C，60s,52°C，60s，72°C，4min),72°C，6min。

c.用1%的琼脂糖胶回收PCR产物（l352bp)。

13.转染Id后，将细胞接种人96孔板，用含SOOug/mlG418的培养基筛选，直到大约1/3的细胞覆盖率。

14.适当扩增细胞，以用于后续的分析。

纯化CAR/hEGF融合蛋白

15.收集稳定表达CAR/hEGF的293细胞的培养基。

16.加人等体积的预冷硫酸铵，沉淀蛋白质。

17.离心收集沉淀，将之溶于原有体积1/20的PBS中。
 

18.用PBS透析。

19.用TALON含钴的金属亲合层析树脂（Clontech)纯化重组蛋白。

20.用PBS透析。

21.通过Western印迹检测表达的蛋白质。

22.检测接头蛋白和Ad载体的靶向效率。

a.将接头蛋白结合到Ad载体上。

b.研究EGFR-标记的Ad转染表达EGFR的细胞的靶向效率。

转录耙向的Ad载体构建

材料

试剂
AdEasy系统（Qbiogene)

琼脂糖

菌株：BJ5183和DH5a

细胞株：293细胞

氯化铯

乙醇

甘油

卡那霉素（25ug/ml)