| 实验方法原理 | 将感兴趣的外源基因亚克隆到质粒转移载体上，外源基因的两端为痘苗病毒基因组非必需基因片段。随后，将重组质粒转染病毒感染的细胞，痘苗病毒基因组与质粒上同源的部分发生同源重组。应用适当的筛选方案，经几轮噬斑纯化，从细胞裂解物中获得重组病毒。 | ||||||||||
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| 实验材料 | pSCll／pRB21／pSC65／pLW9／其他合适载体CV-1／BS-C-1／BHK-21／CEF细胞痘苗病毒储液 试剂、试剂盒 | 完全MEM-10和MEM-2.5培养基转染缓冲液干冰／乙醇胰酶CaCl2 仪器、耗材 | 25cm2组织培养瓶聚苯乙稀管刮刀／橡皮细胞刮刀15ml无菌锥形离心管Sorvall离心机 实验步骤 | 1.将目的基因亚克隆到pSC11、pRB21、pSC65、pLW9或其他合适载体的多克隆位点（MCS）上，分离质粒。 2.将1×106的CV-1、BS-C-1，BHK-21或CEF细胞用完全MEM-10培养基接种到25cm2组织培养瓶中，培养至接近单层生长至汇片的程度（通常过夜）。 3.使用前，将等体积的痘苗病毒储液与0.25mg/ml胰酶混合，涡旋混匀。在37℃水浴锅中保温30min，并在保温过程中每隔5～10min涡旋混匀一次。对于MVA，以在冰上超声30s打散病毒团块代替胰酶解。病毒储液的滴度常常在2×109pfu/ml左右，但根据其来源的不同病毒滴度也可能低一些。 4.用完全MEM-2.5培养基将病毒稀释到1.5×107pfu/ml。在汇片生长的单层细胞培养瓶中吸出培养基，加入1ml稀释的病毒（0.05pfu/细胞）转染。培养2h，每隔15min轻轻摇动一次。在转染结束前30min，按照下面介绍的方法制备DNA。 5.在12mm×75mm聚苯乙稀管中加入1ml的转染缓冲液，再加入5～10μg（<50μl）含有目的基因的重组质粒（来自步骤1）。 6.缓慢地加入50μl2.5mol/LCaCl2，并轻轻混合均匀，在室温放置20～30min，细小的沉淀应该会出现。 7.从单层细胞吸去病毒接种物（步骤4）。 8.将沉淀的DNA悬液（步骤6）加入细胞，室温放置30min，然后加入9ml完全MEM-10培养基37℃培养3～4h。 9.吸出培养基，加入5ml完全MEM-10培养基，37℃培养2天。 10.用刮刀或无菌的橡皮细胞刮刀，轻轻刮下细胞，转移到15ml锥形离心管中，5～10℃，1800g离心5min，弃培养基。 11.将细胞用0.5ml完全MEM-2.5培养基重悬。反复冻融裂解细胞悬液：用干冰/乙醇冷冻使细胞冻结，37℃水浴及涡旋将细胞解冻。如此进行3次。 12.将细胞裂解物置-70℃保存，直至筛选步骤进行（见「重组病毒噬斑筛选实验」）。 注意事项 | 其他 | |
