PfuDNAPolymeraseisahighlyThermostableDNApolymerasefromthehyperthermophilicarchaeumPyrococcusfuriosus.
Description:
PfuDNAPolymeraseisahighlythermostableDNApolymerasefromthehyperthermophilicarchaeumPyrococcusfuriosus.Theenzymecatalyzesthetemplate-dependentpolymerizationofnucleotidesintoduplexDNAinthe5'->3'direction.PfuDNAPolymerasealsoexhibits3'->5'exonuclease(proofreADIng)activity,thatenablesthepolymerasetocorrectnucleotideincorporationerrors.Ithasno5'->3'exonucleaseactivity.ThemaindifferencebetweenPfuandalternativeenzymesisPfu'ssuperiorthermostABIlityand'proofreading'properties.UnlikeTaqDNApolymerase,PfuDNApolymerasealsopossesses3'->5'exonucleaseproofreadingactivity,resultinginPCRfragmentswithfewererrorsthanTaq-generatedPCRinserts.PfuDNApolymeraseisefficientfortechniquesthatrequirehigh-fidelityDNAsynthesis,butcanalsobeusedinconjunctionwithTaqpolymerasetoobtainthefidelityofPfuwiththespeedofTaqpolymeraseactivity.
Application:
-High-fidelityPCRandprimer-extensionreactions
-GenerationofPCRproductsforcloningandexpression
-PCRcloningandblunt-endamplificationproductgeneration
-RT-PCRforCDNAcloningandexpression
-Site-directedmutagenesis
-Blunt-endPCRcloning
Source:
ThermostableDNApolymerasefromhyperthermophilicarchaeonpyrococcusfuriosus.
UnitDefinition:
Oneunitisdefinedastheamountofenzymerequiredtocatalyzetheincorporationof10nmolofdNTPsintoacidinsolublematerialin30minutesat74°CunderstandardDNApolymeraseassayconditions.
SuppliedWith:
10xPfuReactionBuffer(withdNTPs)
10xPfuReactionBuffer(withdNTPs)
200mMTn3pH8.8
20mMMgSO4
100mMKCl
100mM(NH4)2SO4
1%Triton
1mg/mlBSA
2mMdNTP SuppliedIn:
20mMTris-HCl(pH8.0)
40mMNaCl
0.1mMEDTA
1mMDTT
50%(v/v)glycerol
HeatInactivation:
95%inactiveafter1-hourincubationat98°C
RecommendedReactionConditions:
1XPfubuffer,200µMeachdNTP,0.1-0.5µMeachprimer,5unitsPfuDNApolymeraseenzyme,1-100ngplasmidtemplateDNA,or100-250nggenomictemplateDNA.
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利用聚合酶链式反应（PCR），任何两个DNA片段可连接成一个新的重组DNA分子。通过在PCR引物中引入的额外非同源的核苷酸，可在连接处产生所需要的读码框架或酶切位点。用该技术并不需要知道待亚克隆的DNA的核苷酸序列，只需要知道两小段伸展于片段两俩的区段作为扩增反应的引物结合区。
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本实验介绍激活的热稳定 DNA 聚合酶进行反转录和 DNA 扩增。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。
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酶的酶活性为了进一步验证检测方法的可行性,选择两种商品化T4DNA聚合酶进行检测,商品化T4DNA聚合酶1为NEB-T4DNAPolymerase,商品化T4DNA聚合酶2为Enzymatics-T4DNA...
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一般来说，以DNA为模板的DNA聚合酶和RNA聚合酶都的结合位点都在DNA上。
但是也有以RNA为模板的DNA聚合酶和RNA聚合酶 （也就是反转录酶和RNA依赖的RNA聚合酶）,它们的结合位点在RNA上.
也就是说，模版是谁，结合位点就在谁上。
2.结合位点就是启动合成DNA或者RNA的碱基序列，如RNA聚合酶结合位点是转录起始位点,是一段特殊的位于编码基因上游的DNA序列.这段DNA序列可以结合RNA聚合酶,从而起始转录过程.经典的RNA聚合酶结合位点是TATA box.
TATA box是编码序列前的4个碱基.在大多数生物的基因前面都有TATA着4个碱基序列的存在,它就是一个RNA聚合酶结合位点.
A、DNA转录形成RNA时需要RNA聚合酶的催化，底物是核糖核苷酸，A错误；
B、酶大部分是蛋白质、少量是RNA，故某种酶的基本组成单位是氨基酸或核糖核苷酸，B错误；
C、内分泌细胞能产生激素，活的细胞能产生酶，故能产生激素的细胞就能产生酶，C正确；
D、酶通常是蛋白质，蛋白质在低温条件下更加稳定，利于保存，而且低温不会使酶失活，因此在最适温度保存没有意义，D错误．
相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。
不同点
1、作用底物不同。RNA聚合酶底物是NTP；DNA聚合酶底物是dNTP。
2、RNA聚合酶作用不需要引物，而DNA聚合酶作用需要引物。
3、RNA聚合酶本身具有一定的解旋功能，而DNA聚合酶没有，当需要解开双链的时候要解旋酶和拓扑异构酶的帮助。
4、RNA聚合酶只具有5‘到3’端的聚合酶活性，而DNA聚合酶不仅有5‘到3’端的聚合酶活性，还具有3‘到5’端的外切酶活性。保证DNA复制时候校对，所以复制的忠实性高于转录的。
5、RNA聚合酶通常作用于转录过程；DNA聚合酶通常作用于DNA复制过程
观察以下dna结构图，判断dna聚合酶能够与哪一个结合
可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。前两者是DNA聚合酶，它使DNA复制链按模板顺序延长。如在原核生物中仅就大肠杆菌中已被发现的就有三种(分别简称为PolⅠ，PolⅡ和PolⅢ等)；DNA聚合酶只能在有引物的基础上，即在DNA或RNA引物的3′-OH延伸，这DNA的合成方向记为5′→3′。换言之DNA聚合酶催化反应除底物(αNTP)外，还需要Mg2+ 、模板DNA和引物，迄今细胞内尚无发现可从单体起始DNA的合成。同样，上述(3)和(4)是催化RNA生物合成反应中最主要的RNA合成酶，它们以四种三磷酸核糖核苷(NTP)为底物，并需有DNA模板以及Mn2 及Mg2 的存在下，在前一个核苷酸3′-OH与下一个核苷酸的5′-P聚合形成3′，5′-磷酸二酯键，其新生链的方向也是5′→3′。RNA聚合酶也大量存在于原核和真核生物的细胞中。如大肠杆菌RNA聚合酶分子量4.8×105，由5条多肽链组成，分别命名为α，α，β，β′，和γ，全酶可用α2ββ′λ表示。真核生物RNA聚合酶分子大于5×105，由10～12个大小不等亚基组成。聚合酶除作为自然界生命活动中不可缺少的组分外，在实验室中大多用作生命科学研究的工具酶类之一。
各位，我需要做基因的序列测定检测突变，想请教一下各位用过哪个公司的哪种高保真酶比较好？（最好是保真性能高而且扩增效率也好）谢谢！
DNA聚合酶：在DNA复制时，作用于游离的脱氧核苷酸，将游离的脱氧核苷酸连接形成新的脱氧核苷酸长链。
解旋酶：在DNA复制、转录时，作用于DNA双链，将双链DNA解开形成单链。
RNA聚合酶：在转录过程中，作用于游离的核糖核苷酸，将它们连接形成mRNA链
不是
DNA聚合酶和DNA连接酶作用的位点都是3'5'磷酸二酯键；但DNA连接酶是作用在游离的DNA片段间，使其连接成为一条完整的DNA链，而DNA聚合酶则是将游离的脱氧核糖核苷酸连接成DNA片段。
最近忽然对我们平常用的DNA聚合酶发生研究兴趣，想问下园子里面有没有谁实验室有那些个hot-start、Pfu之类的
DNA聚合酶的重组质粒
载体？这些酶的活性或是保真性应该强于我们平时使用的Taq酶，谁要是很幸运的找老外讨到了这些重组的质粒载体，PM我，谈谈交换的条件，呵呵！
DNA
连接酶与
DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将()加到己有的
核苷酸片段末端，形成磷酸二酯键。DNA链接酶是链接()的末端，形成磷酸二酯键。
DNA聚合酶作用于DNA复制时，用于连接两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键以及碱基互补配对时的氢键。
DNA连接酶作用于基因工程，用于连接两个DNA片段间的磷酸二酯键。
TaqDNA聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感。以活性程度很低的鲑鱼精子DNA为模板，dNTP的浓度为0.7～0.8mmol/L时，用不同浓度Mg2+进行PCR反应10min，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L时该酶催化活性最高，此浓度能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在10mmol/L时可抑制40～50%的酶活性。由于Mg2+能与dNTP结合而影响PCR反应液中游离的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度。一般反应中Mg2+浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0mmol/L。适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L，高于75mmol/L时明显抑制该酶的活性。
DNA聚合酶有特异性的，DNA聚合酶只能催化核苷酸与核苷酸短链的连接,且具有方向性，由DNA5'端点开始复制到3'端的。
我要P一个3kb左右的目的基因，需要一个保真性高的酶，因为后面要测序，而且我的两个引物的GC含量相差也很大，还需要一个载体连接去进行筛选，这个载体要4kb以上的，因为要和我的目的基因大小相差大一点的，而且这个载体上还要有多个切割位点，好让我切割下来，与最终的质粒相连。
最近，我看了很多这方面的资料，但是我对这个方面不是很了解，所以现在搞得头昏眼花的，不知道该选什么酶和载体，希望大家多多帮忙
在此十分感谢
