免 疫 组 织 化 学 法 实 验一免疫酶技术

免疫酶技术

免疫组化技术种类繁多，通常对经典方法的改进可优化免疫反应，提高对抗原的检测。任何一种免疫组化方法的最终目标是：在尽可能少的背景下，检测到最大量的抗原(最大值的信噪比）。过去，只能采取一些直接法(用酶或荧光染料标记一抗），虽然可快速地检测到抗原，但敏感性低。间接法是指不标记一抗的一些方法，这些方法由两层或两层以上的试剂组成，通常最后一层含有标记，操作起来比较繁琐，但敏感性较高（是直接法的几百倍），是目前IHC中较常用的方法。通常有这样一个规律(但也有例外），实验技术越复杂其灵敏度也越高。这部分将重点介绍福尔马林固定、石蜡包埋切片的免疫酶技术，而对于在其他固定剂固定的组织、冷冻切片、细胞离心涂片等，该技术也相似。选择什么方法要根据要检测抗原的量、所需敏感度水平、实验室技术能力等。目前有许多检测试剂盒；下面介绍的技术中我们将使用一些适用于自动染色仪器的市售试剂盒。可在自动染色仪器中操作的步骤取决于仪器型号种类。

直接法

方法

(1)切片用二甲苯或其替代物脱蜡两次。

(2)100%乙醇（两次，每次5min),95%乙醇（两次，每次5min)水化切片。用水清洗切片充分洗掉乙醇。

(3)如果需要加热抗原修复或37°C酶抗原修复，可在这一步进行。

(4)将切片在缓冲液中放置5min，然后转移到自动染色仪器中。

(5)阻断内源性过氧化物酶。

(6)缓冲液中清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复（如果需要），5min。

(8)将切片在非特异封闭液中孵育1〇〜2〇min。

(9)不要清洗，将液体吹干（如果徒手操作用滤纸吸干）。

(10)将切片在标记的一抗中解育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)将切片在DAB溶液中孵育5〜lOmin。

(13)用蒸馏水清洗切片。

(14)Mayer’s苏木精复染。

(15)蒸馏水清洗切片，用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(16)95%乙醇(两次，每次3〜5min)，100%乙醇（两次，每次3〜5min)，二甲苯或代替物（两次，每次3〜5min)脱水。

(17)用合成封固剂封片。

结果

抗原/抗体反应部位:棕色。

细胞核:蓝色。

间接法

间接免疫酶法

下面是两步法的第一步。

方法
(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)在100%乙醇(两次，每次2min),95%乙醇(两次，每次2min)水化切片。用水清洗切片，充分洗掉乙醇。

(3)如果需要热诱导抗原修复或37°C酶法抗原修复，可在这一步进行。

(4)将切片在缓冲液中放置5min，然后转移到自动染色仪器中。

(5)阻断内源性过氧化物酶。

(6)缓冲液中清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复(如果需要），5min。

(8)将切片在非特异封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干（如果徒手操作可用滤纸吸干）。

(10)将切片在未标记的一抗中娜育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在标记的二抗中孵育30min。

(13)用漂洗缓冲液清洗三次。

(14)将切片在DAB溶液中孵育5〜lOmin。

(15)用蒸馏水清洗切片。

(16)Mayer’s苏木精复染。

(17)蒸馏水清洗切片，用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(18)依次用95%乙醇（两次，3〜5min)，100%乙醇（两次，3〜5min)，二甲苯或代替物（两次，3〜5min)脱水。

(19)用合成封固剂封片。

结果

抗原/抗体反应部位:榇色。

细胞核:蓝色(如果抗原为核蛋白，胞核的颜色则是棕色和蓝色的混合色）。

注意事项

尽管通常在孵育一抗前对内源性过氧化物酶进行阻断，但有些抗原（尤其是CD)对这一操作十分敏感，若所使用的过氧化氢溶液浓度较高，将会更加敏感。这种情况下，此项操作可以在孵育一抗后，添加含过氧化物酶的试剂之前进行。

聚合物免疫酶法

这种方法比间接法更灵敏。在一个高分子惰性骨架（如葡聚糖微球)上结合许多分子标记(如过氧化物酶）以及可识别一抗的免疫球蛋白分子（如山羊抗兔免疫球蛋白）（本例中连接的是兔免疫球蛋白）。由于反应中不涉及亲和素或生物素分子，因此该方法的另外一个优点是不存在内源性亲和素-生物素背景。高分子技术检测试剂盒通常要比亲和素-生物素方法昂贵。

方法

(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)用100%乙醇(两次，每次5min),95%乙醇（两次，每次5min)水化切片。

(3)如果需要热诱导表位决定簇恢复或37。(3酶法抗原修复，可在这一步进行。

(4)将切片在缓冲液中放置5min。

(5)封闭内源性过氧化物酶。

(6)缓冲液中清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复（如果需要），5min。

(8)将切片在非特异结合封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干（如果徒手操作用滤纸吸干）。

(10)将切片在未标记的一抗中孵育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在高分子-免疫球蛋白-酶复合体中孵育30min。

(13)用漂洗缓冲液清洗三次。

(14)将切片在DAB溶液中孵育5〜lOmin。

(15)用蒸馏水清洗切片。

(16)Maye^s苏木精复染（通常在自动染色器外操作）。

(17)蒸馏水清洗切片，用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(18)依次95%乙醇（两次，3〜5min)、1〇〇%乙醇（两次，3〜5min)、二甲苯或代替物(两次，3〜5min)将切片脱水。

(19)用合成封固剂封片。

结果

抗原/抗体反应部位:踪色。

细胞核：蓝色（如果抗原为细胞核，则胞核的颜色是棕色和蓝色的混合色）。

多步法

多步法要比间接法繁琐但灵敏高。该方法以亲和素（avidin，卵白中发现的一种糖蛋白）或链亲和素（streptavidin，为菌中的一‘种糖蛋白）与生物素（biotin，蛋黄中的一种糖蛋白）之间的高亲和力为基础。亲和素含有4个亚基，组成了三级结构中含有4个疏水性生物素的结合位点，但亲和素含有的低聚糖残基对组织成分具有一定的亲和力，导致非特异性结合。链亲和素缺乏低聚糖残基且其等电点为中性，因此产生的背景较低。通常生物素连接到二抗或酶上（每分子免疫球蛋白可连接多达150分子的生物素）。亲和素-生物素方法中的标记分子通常为亲和素分子（第三层试剂）。该方法是目前免疫组织化学中灵敏度高，且应用最为广泛的方法（图11.3)。

链亲和素-生物素标记法

(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)依次用100%乙醇(两次,每次5min)，95%乙醇(两次，每次5min)水化切片。

(3)如果需要热诱导抗原决定簇修复或37°C酶法抗原修复，可在这一步进行。

(4)将切片在缓冲液中放置5min，然后放到自动染色仪器中。

(5)封闭内源性过氧化物酶。

(6)用缓冲液清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复（如果需要），5min。

(8)将切片在非特异封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干（如果徒手操作可用滤纸将液体吸干）。

(10)将切片在未标记的一抗中孵育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在生物素化的二抗中孵育30min。

(13)用漂洗缓冲液清洗三次。

(14)在第三层试剂中孵育（过氧化物酶标记的亲和素/链亲和素）30min。
(15)用漂洗缓冲液清洗三遍。

(16)在DAB溶液中孵育5〜lOmin。(17)蒸馏水清洗切片。

(18)Mayer’s苏木精复染(通常在自动染色仪器外操作）。

(19)蒸馏水清洗切片，用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(20)95%乙醇（两次，3〜5min)、100%乙醇(两次，3〜5min)、二甲苯或代替物（两次，3〜5min)脱水。

(21)用合成封固剂封片。

结果

抗原/抗体反应部位:棕色。

细胞核:蓝色（如果抗原在核内，则胞核的颜色是掠色和蓝色的混合色）。

链亲和素生物素复合体法

方法

(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)依次用100%乙醇(两次，每次5min),95%乙醇(两次，每次5min)水化切片。

(3)如果需要热诱导抗原决定簇修复或37°C酶法抗原修复，可在这一步进行。

(4)将切片在缓冲液中放置5min。

(5)阻断内源性过氧化物酶。

(6)用缓冲液清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复（如果需要），5min。

(8)将切片在非特异封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干（如果徒手操作可用滤纸将液体吸干）。

(10)将切片在未标记的一抗中孵育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在生物素化的二抗中孵育30min。

(13)用漂洗缓冲液清洗三次。

(14)在第三层试剂（亲和素-链亲和素-过氧化物酶复合体）中孵育30min。

(15)用漂洗缓冲液清洗三遍。

(16)在DAB溶液中孵育5〜lOmin。

(17)蒸馏水清洗切片。

(18)Mayer、苏木精复染（通^在自动染色器外操作）。

(19)蒸馏水清洗切片，用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(20)依次用95%乙醇(两次，3〜5min)、100%乙醇（两次，3〜5min)、二甲苯或代替物（两次，3〜5min)脱水。

(21)用合成封固剂封片。

结果

抗原/抗体反应部位:棕色。

细胞核:蓝色（如果抗原在核内，则胞核的颜色是棕色和蓝色的混合色）。

注意事项

亲和素和过氧化物酶溶液在加到玻片上之前需在试管内预孵育以形成复合物。

酪胺法（亲和素-生物素或荧光素法)

与传统ABC方法相比，酪胺法可将免疫反应放大1〇〇〜1000倍，一抗的稀释倍数也可提高几百倍。与亲和素或抗荧光素抗体结合的过氧化物酶与酪胺二次反应后，生物素或荧光素标记的酪胺分子发生沉淀是该方法的基本原理。最初，该方法是以亲和素-生物素结合为基础，但这种结合反应的高敏感性也增加了内源性亲和素-生物素产生背景的机会。最近发展的一种荧光素的方法虽然可以避免这种问题的发生，但敏感性也降低了，而且仍然可能产生背景。目前有文章报道了改进的可降低背景的酪胺法[11]。

方法

(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)依次用100%乙醇(两次，每次5min)、95%乙醇（两次，每次5min)水化切片。

(3)如果需要热诱导抗原修复或37°C酶法抗原修复，可在这一步操作。

(4)将切片在缓冲液中放置5min。

(5)封闭内源性过氧化物酶。

(6)缓冲液中清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复（如果需要），5min。

(8)将切片在非特异封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干(如果徒手操作可用滤纸将水吸干）。

(10)将切片在未标记的一抗中孵育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在生物素标记的F(ab’)2抗（亲和素-生物素法）或过氧化物酶标记的抗鼠IgG(荧光素法）中孵育15min。

(13)用漂洗缓冲液清洗三遍。

(M)对于亲和素-生物素法，用过氧化物酶-链亲和素-生物素复合体孵育15min;而对于荧光素法，用荧光素标记的酪胺放大系统试剂孵育15min。

(15)用漂洗缓冲液清洗三遍。

(16)对于亲和素-生物素法，用生物素标记酪胺放大系统试剂孵育15min;而对于荧光素法，用过氧化物酶标记抗荧光素抗体孵育15min。

(17)用漂洗缓冲液清洗三次。

(18)对于亲和素-生物素法，用过氧化物酶-链亲和素复合体孵育15min;而对于突光素法，直接进行步骤（20)。

(19)用漂洗缓冲液清洗三次。

(20)在DAB底物-色原中孵育5min。

(21)用蒸馏水清洗。

(22)Mayer’s苏木精复染。

(23)蒸馏水清洗切片，用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(24)依次用95%乙醇（两次，每次3〜5min)、100%乙醇（两次，每次3〜5min)、二甲苯或代替物(两次，每次3〜5min)脱水。

(25)用合成封固剂封片。

结果

抗原/抗体反应部位:棕色。

细胞核:蓝色（如果抗原为细胞核，则胞核的颜色是棕色和蓝色的混合色）。

免疫组化检测多抗原

一直以来，检测同一组织切片中的多个抗原较为困难。有些检测试剂盒通过标记两种不同的酶(如HRP和AP)来检测至少两种抗原。这种试剂盒灵敏度很高但价钱也十分昂贵。多抗原检测的关键问题在于抗原的部位(相同的或不同的组织、细胞或细胞器）。必须精心选择每种抗原的色原以使抗原之间实现最好的区分。VectorLaboratories公司的目录包括很多双重免疫染色中酶底物组合使用的例子（www.vectodabs.com)。如果
两种抗原位置十分接近（如这两种抗原在同一细胞类型的细胞核中），那么染色后能清楚看到两种抗原的机会就会降低。另外，由于不同抗原修复方法不同，双重免疫检测变得更加复杂。换句话说，一种抗原的修复方法可能对另一种抗原有害。想对多抗原免疫染色有系统的了解可以阅读vanderLoos关于多免疫酶染色法的专著[如。这里我们收录了两种双重免疫酶法方案，一个是使用不同物种的一抗，另外一个是使用源于同一物种的一
抗（图11.4)[13]。

抗来源于不同动物的双免疫酶染色法[12]

该方法为应用不同动物种类的一抗进行直接/间接染色。

方法

(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)依次用100%乙醇（两次，每次5min)、95%乙醇（两次，每次5min)水化切片。

(3)如果需要热诱导抗原修复或37°C酶法抗原修复，可在这一步操作。

(4)将切片在缓冲液中放置5min。

(5)封闭内源性过氧化物酶。

(6)缓冲液中清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复(如果需要），5min。

(8)将切片在非特异结合封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干（如果徒手操作可用滤纸吸干）。

(10)将切片在两种未标记的一抗中解育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在二抗混合液（HRP标记山羊抗小鼠和AP标记山羊抗兔）中孵育30min

(13)用漂洗缓冲液清洗三次。

(14)第一个抗体酶底物反应（AP色原)5min。

(15)用漂洗缓冲液清洗三次。

(16)第二个酶底物反应（HRP色原)5min。

(17)蒸馏水清洗。

(18)在DAB底物-色原中孵育5min。

(19)Mayer7S苏木精复染（通常在自动染色器外操作）。

(20)用蒸馏水清洗切片。用稀释的氢氧化铵溶液蓝染切片。

(21)用合适的封固剂封片。

结果

对DAB-HRP和固红-AP而言，反应的颜色分别为棕色和红色。

注意事项

(1)一抗的浓度至少是单独免疫组织化学方法中一抗浓度的两倍。

(2)选择合适的颜色组合很关键，主要取决于组织切片中抗原的量和位置。

(3)复染不应该覆盖免疫反应的颜色。

抗来源于同一动物的顺序双免疫酶染色法[1«

该方法的优点在于所使用的一抗可源于同一物种，然而操作起来较为繁琐，在一抗和二抗免疫反应之间需要有洗脱或阻断的步骤。目前有市售的基于多聚体技术的试剂盒(如ENVIS〇ION、DakoUSA、Carpinteria、CA)

方法

(1)切片用二甲苯或替代物脱蜡两次。

(2)依次用100%乙醇(两次，每次5min)、95%乙醇(两次，每次5min)水化切片。

(3)如果需要热诱导抗原决定簇修复或37°C酶法抗原修复，可在这一步操作。

(4)将切片在缓冲液中放置5min。

(5)封闭内源性过氧化物酶。

(6)用缓冲液清洗切片。

(7)室温下，蛋白酶K法抗原修复（如果需要），5min。

(8)将切片在非特异结合封闭液中孵育10〜20min。

(9)不要清洗，将残留液体吹干（如果徒手操作可用滤纸吸干）。

(10)将切片在未标记的一抗中赌育30min。

(11)用漂洗缓冲液清洗三次。

(12)在ENVISION的过氧化物酶中孵育30min。

(13)漂洗缓冲液清洗三次

(14)用DAB-色原试剂反应5min。

(15)用DAKO的双染封闭液洗脱，或者在pH6.0的柠檬酸缓冲液中煮沸5min。

(16)漂洗缓冲液清洗三次。

(17)将切片在非特异封闭液中孵育10min。

(18)不要清洗，将残留液体吹干(若徒手操作可用滤纸吸干）。

(19)再用抗小鼠或抗兔的第二种二抗孵育30min。

(20)用漂洗缓冲液清洗三次。

(21)在ENVISION或AP中孵育30min。

(22)用漂洗缓冲液清洗三次。

(23)用固红显色AP酶活性5〜30min。

(24)用蒸馏水清洗。

(25)用Mayer』s苏木精复染。

(26)水性封固剂封片。

结果

对DAB-HRP和固红-AP而言，反应的颜色分别为棕色和红色。

注意事项

一般建议首先进行HRP与DAB显色反应，这个色原可以屏蔽第一套试剂，避免第一次和第二次染色反应间存在交叉。m