Note: The product is for research use only, not for use in diagnostic or therapeutic procedures |
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Product Name | Cyclin D1 Colorimetric Cell-Based ELISA Kit |
Assay Type | Cell-Based |
Sub Type | None |
Detection Method | Colorimetric 450 nm |
Synonyms | BCL-1 oncogene; BCL1; cyclin D1; CYL-1; G1/S-specific cyclin D1; PRAD1; PRAD1 oncogene |
Storage/Stability | 4°C/6 Months |
Dynamic Range | > 5000 Cells |
NCBI Gene Symbol | CCND1 |
Database Links |
Gene ID: 595 UniProt ID: P24385 OMIM #: 168461/254500 Unigene #: Hs.523852/Hs.667996 |
AssayBiotechnology公司成立于2006年,位于美国洛杉矶。AssayBiotechnology公司有超过六千种抗体,涵盖了各种研究和应用领域。另外,AssayBiotechnology公司还拥有一千多种磷酸化抗体,同时公司正努力生产所有人类genowide抗体,针对到2015年为止出版过的调控磷酸化位点的抗体。作为可靠的高质量抗体生产商,AssayBiotechnology公司拥有多年研发经验的高级科学家确保了公司抗体的高品质,高特异性,100%的保证抗体质量。
AssayBiotechnology公司利用主要由混合抗原均一化技术和人类cDNA/EST噬菌体表面呈现文库技术两项具有自主知识产权的专有技术组成抗人类蛋白单克隆抗体大规模开发生产平台,完美地解决了传统的单克隆抗体生产耗时过长及成本过高的瓶颈。AssayBiotechnology公司可在较短的时间内将剩余的抗人类基因编码蛋白质单克隆抗体开发完,从而建立世界上第一个与人类基因库相配套的抗人类蛋白单克隆抗体库和抗原库(该抗体库和抗原库与国际上通用的GenBank相链接),并建成全球种类最多和规模最大的抗人类蛋白单克隆抗体生产体系和销售中心。
与人类基因相联系的抗体蛋白与抗原蛋白信息是有限的,并且每一个抗体与抗原蛋白相关信息都是唯一的和不可复制的,和人类基因组计划一样,谁先开发出来谁就拥有垄断优势。AssayBiotechnology公司开发出抗体库和抗原库之后,将对每一个新发现的和有价值的抗体与抗原信息申请专利保护,以后所有应用到这些抗体与抗原信息的需求者(例如药物靶点筛选)都必须向AssayBiotechnology公司购买使用许可,因而这是最新生命科学领域的战略高地。
自2006年1月成立以来,AssayBiotechnology一直是行业*的抗体生产和工程及分析技术,荧光染料,淬灭剂,重组蛋白和合成肽的全球贡献者。我们位于加利福尼亚州旧金山湾区的中心地带,致力于满足全球对医疗和学术研究中使用的高质量检测试剂盒和免疫试剂的需求,这些试剂主要构成医疗保健的基础。详细产品列表:AssayBiotech全国代理 货号产品规格OK-01004-1BB-R(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0101BD-1(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0102BD-2(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0103BD-3(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0104BD-4(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0105Betacellulin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0106beta-NGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0107BMP-2(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0108CNTF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0109CTGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0110CXCL-16(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0111EGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0112EG-VEGF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0113Eotaxin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0114Eotaxin-3(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0115FGF-Basic(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0116Follistatin(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0117G-CSF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0118GM-CSF(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsOK-0119GRO/MGSA(Human)OmniKine™ELISAKit12x8-WellMicrostripsA000114-3-3zeta(Phospho-Ser58)Antibody50ulA0002ADD1(Phospho-Ser726)Antibody50ulA0003AMPKalpha1/2(Phospho-Thr183/172)Antibody50ulA0004AmyloidbetaA4(Phospho-Thr743/668)Antibody50ulA0005CaMK2alpha/beta/delta(Phospho-Thr305)Antibody50ulA0006CREB(Phospho-Ser142)Antibody50ulA0007DARPP-32(Phospho-Thr75)Antibody50ulA0008EGFR(Phospho-Thr678)Antibody50ulA0009EGFR(Phospho-Thr693)Antibody50ulA0010EFNB1/2(Phospho-Tyr330)Antibody50ulA0011GABA-RB(Phospho-Ser434)Antibody50ulA0012GSK3alpha/beta(Phospho-Tyr279/216)Antibody50ulA0013HSP90B(Phospho-Ser254)Antibody50ulA0014IkappaB-beta(Phospho-Ser23)Antibody50ulA0015IkappaB-epsilon(Phospho-Ser22)Antibody50ulA0016Keratin18(Phospho-Ser33)Antibody50ulA0017Keratin8(Phospho-Ser73)Antibody50ulA0018MAPKAPK2(Phospho-Thr334)Antibody50ulA0019MEF2A(Phospho-Ser408)Antibody50ulA0020Myc(Phospho-Ser62)Antibody50ul
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2、封闭液肯定不好
3、显色时用封口膜盖好
请大家帮帮忙,第一步加完抗原后必须封闭吗
2.加大辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素;
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂:(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型:
1.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:
1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2) 加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3) 加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4) 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测。
在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应。采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心。
2.双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法。
3.间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:
1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2)加稀释的受检血清,保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3)加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体,但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4)加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果,但应尽可能予以纯化,以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质,例如以E.Coli为工程酶的重组抗原,如其中含有E.Coli成份,很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质,例如来自人血浆或人体组织的抗原,如不将其中的Ig去除,试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白,也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强,非特异IgG可直接吸附到固相载体上,有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中,抗原包被后一般用无关蛋白质(例如牛血清蛋白)再包被一次,以封闭(blocking)固相上的空余间隙。另外,在检测过程中标本须先行稀释(1:40~1:200),以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
4.竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去,或不易得到足够的纯化抗原时,可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多,结合在固相上的酶标抗体愈少,因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的,可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质,直接包被不易成功,可采用捕获包被法,即先包被与固相抗原相应的抗体,然后加入抗原,形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质,然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式,可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合,洗涤后再加入酶标抗体,与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
5.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
6.捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体,因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体,后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗,间接测定IgM抗体,必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理,以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相,以捕获血清标本中的IgM(其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM)。然后加入抗原,此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用,呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒(HAV)抗体的检测模式。
类风湿因子(RF)同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体,导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐,用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
7.ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白,分子量60000,每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物,分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物,标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性,其亲和力较抗原抗体反应大得多,两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合,因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素(LAB)法和桥联亲和素-生物素(ABC)法两种类型。两者均以生物素标记的抗体(或抗原)代替原ELISA系统中的酶标抗体(抗原)。在LAB中,固相生物素先与不标记的亲和素反应,然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期,亲和素从蛋清中提取,这种卵亲和素为碱性糖蛋白,与聚苯乙烯载体的吸附性很强,用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点,在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂,增加了操作步骤,在临床检验中ABS-ELISA应用不多。
下图为ELISA原理图,夹心法即Sandwich ELISA,竞争法就是Competitive ELISA
向左转|向右转
表面抗体是双抗原夹心法
E抗体和核心抗体是竞争抑制法或间接法
(1) 包被:用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗3次,每次3分钟。(简称洗涤,下同)。
(2) 加样:加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔,阴性对照孔及阳性对照孔)。
(3) 加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小时,洗涤。
(4) 加底物液显色:于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分钟。
(5) 终止反应:于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
(6) 结果判定:可于白色背景上,直接用肉眼观察结果:反应孔内颜色越深,阳性程度越强,阴性反应为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+”、“-”号表示。也可测O·D值:在ELISA检测仪上,于450nm(若以ABTS显色,则410nm)处,以空白对照孔调零后测各孔O·D值,若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍,即为阳性。
间接法:
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中,加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml,37℃孵育30-60分钟,洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
大家好,我在做双抗夹心法的elisa实验,已经花了20来天了,然而标准曲线的线性一直做不好,而且不稳定。下面我把具体的实验过程说下,希望大家能给我提个建议,谢谢!
首先我从以下数据中确定了标准品的起始稀释浓度:4.64,46.4,464,4640IU/ml对应的OD为0.55,1.178,1.086,1.168.因此我取46.4IU/ml(300ng/ml)作为标品的起始稀释浓度。然后作了关于单抗,多抗,二抗的合适稀释度的实验,我的数据如下:
123456789
空白0.2290.1920.2120.1540.1390.1730.2360.1770.257
46.4iu/ml1.2421.5271.2691.9641.6281.9592.0051.8802.163
9.28iu/ml0.9680.9501.0131.1360.8731.2461.6971.5861.769
阴性0.1920.1760.2500.1310.1610.1540.1990.2190.244
选取了7号组合单抗,多抗,二抗分别为1ug/ml,1ug/ml,0.5ug/ml。
标品按照以下梯度稀释:46.423.211.65.82.91.450.725iu/ml.以下是我近来做的三组数据,都是相对空白的相对值:
123
46.4iu/ml0.6130.5860.851
23.20.5240.6490.765
11.60.3820.510.663
5.80.3160.3850.567
2.90.2880.3190.37
1.450.2890.1340.303
0.7250.1210.1460.113
空白0.0820.0870.101
阴性0.0820.1050.101
似乎梯度都不明显。我现在疑惑的是我的标品浓度的设置有问题还是之前抗体的浓度选择不合适,请大家多指点,万分感谢!!!
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