细胞分离纯化技术一Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化淋巴细胞和淋巴母细胞
| 实验方法原理 | Percoll是一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒。渗透压很低（<20mosm/kgH2O），粘度也很小，可形成高达1.3g/ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力（200～1000g）于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 实验材料 | Percoll 试剂、试剂盒 | PBS血清 仪器、耗材 | 试管注射器离心机 实验步骤 | 1. 不同浓度（密度）Percoll溶液的制备 先用9份Percoll与1份8.5％NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压，然后用生理溶液（0.85％NaCl或0.15MPBS）稀释到所需浓度。 Percoll浓度（％） 70 60 50 40 30 20 比重（g/ml） 1.090 1.077 1.067 1.056 1.043 1.031 2. 不连续密度梯度Percoll层的制备 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置，有时相邻两层Percoll比重相差不大时，可将Percoll液放入注射器中，小针头斜面紧贴管壁，任其自然慢慢流下。 3. 装样 样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。 4. 离心 一般采用离心力为400g，时间20～25min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。 5. 取样 当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞；有时大部分细胞位于Percoll层中，则需要逐层收集。收获含有Percoll液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。 其他 | 一、分离纯化细胞举例 1. 富含NK活性大颗粒淋巴细胞（LGL）的纯化 按顺序由下向上逐层加50％、47.5％、45％、42.5％和40％五种不同密度的Percoll，如用10ml试管（或塑料管）分离，每层Percoll约1.2～1.5ml，初步从外周血中分离的PBMC细胞1×108悬于1ml培基中，按要求装样、离心和取样。一般富含NK杀伤活性的LGL细胞位于42.5％与45％Percoll界面以及上下二层的Percoll液中。 2. 纯化淋巴母细胞和除去死细胞 分别叠加50％和30％Percoll液。收取经PHA（或其它抗原、有丝分裂原）刺激PBMC，或含有较高比例异型的PBMC（如肾综合征出血热患者），按要求装样、离心和取样。位于管底的淋巴细胞为小淋巴细胞；两层Fercoll之间为淋巴母细胞，纯度和回收率在80％以上，位于30％Percoll表面是死细胞。收获淋巴母细胞可进行表型、结构以及功能的研究。 二、人不同血细胞的漂浮密度 人不同血细胞的漂浮密度 细 胞 漂浮密度 红细胞 1.09-1.11 粒细胞 嗜酸性 1.09-1.095 嗜中性 1.080-1.085 单核细胞 1.050-1.066 血小板 1.030-1.060 淋巴细胞 1.052-1.077 B淋巴细胞 1.062-1.075 T淋巴细胞 1.065-1.077 淋巴母细胞 1.065-1.077 自然杀伤细胞 1.050-1.070 |
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发布于 ： 2021-07-25
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