DNA荧光染色法：

1.原理：利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst33258）侦测支原体污染。此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine(A-T)rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。

2.测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicatorcell，例如Verocellor3T6cell），然后培养指示细胞再作荧光染色。正负反应对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照。

3.待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。

4.特点：简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不易培养之支原体，例如M.hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。

5.缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。

材料：

1.Hanks’balancedsaltsolutionwithoutNaHCO3orphenolred(HBSS,GibcoBRL21250-014：、bisbenzimide(HoechstNo.33258,SigmaB-2883)、thimerosol(SigmaT-5125)、0.1Mcitricacid、02Mdisodiumphosphate、glycerol、glacialaceticacid、methanol、strerileH2O、chamberslide(Nunc177380)或chamberslide替代物：35or60mmsterileplate内放置无菌22x22mm盖玻片：浸于酒精内，使用前过火灭菌：，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。

2.Indicatorcells：Vero(Africangreenmonkeykidney,ATCCCCL-81orCCRC60013)or3T6(mousefibroblast,ATCCCCL-96orCCRC60070)，细胞须先测试无污染。αMEMwith10%FBS(mediumforVerocell)

配制试剂：

1.无菌HBSS：配制Hanks’balancedsaltsolution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。勿用高压蒸汽灭菌。

2.Hoechst33258stocksolution（100X）：称取5.0mgbisbenzimide和10.0mgthimersol溶于100ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。

3.Hoechst33258workingreagent：取1mlHoechst33258stocksolution，加入sterile100mlHBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。

4.mountingsolution：22.2ml0.1Mcitricacid和27.8ml0.2MNa2HPO4加入于50mlglycerol中混合，以1NNaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。

5.固定溶液（fixative）：冰醋酸与甲醇以1：3之体积比例混合，使用前才配制。

步骤：

1.培养Vero细胞：Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。

2.在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4cells／ml培养于chamberslide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃,5％CO2培养。隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。

3.接种测试样品：样品种类：1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下：，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。

4.将测试样品加入chamberslide内，培养5天后，进行Hoechst33258的荧光染色观察。

5.以AcholeplasmalaidlawiiATCC23206感染Vero细胞作为正反应对照组：或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液：，负反应对照组为Verocell之新鲜培养基(αMEM+10%FBS)。

6.DNA荧光染色检测：①取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。于每个well中加入2ml1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10min后，吸除固定液。重复上述之步骤，风干10分钟。②于每个well中，加入1mlHoechst33258workingsolution，室温下静置30min。③吸掉Hoechst33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mountingsolution，并以盖玻片覆盖之。④以100x-400x荧光显微镜观察。打开水银光源10min后，以UV激发光束(330～380nm)之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。结果判读：

若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。其荧光可维持数星期。图例(A)为negativeresult：荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。(为positiveresult：在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。

(A)Negativeresult荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。