直接原位PCR
| 实验方法原理 | 原位PCR是原位杂交细胞定位和PCR的高灵敏度相结合的技术，使得靶基因检测有了极大的改进。此技术是在细胞（爬片、甩片或涂片）或组织（石蜡、冰冻切片）上直接对靶基因片段进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。 | ||||||
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| 实验材料 | 细胞或组织样品 试剂、试剂盒 | 福尔马林二甲苯PBSTris-HCl Triton-X100蛋白酶KPCR反应缓冲液Tag酶Tween-20指甲油无水乙醇苏木素染色液 NP-40NaClMgCl2BSADAB过氧化氢盐酸酒精液 仪器、耗材 | 玻片湿盒滤纸显微镜 实验步骤 | 一、组织切片和细胞样品的制备 1. 试剂与配置 10%福尔马林；二甲苯；PBS。 2. 操作方法 （1）用10%福尔马林固定组织8~15h，石蜡包埋，切片（4μm），将切片置于新鲜的二甲苯中处理5min，放入无水乙醇中浸泡5min，取出，空气干燥； （2）对于培养细胞，可直接制备爬片，也可有PBS洗细胞一次，加10%福尔马林静置过夜，用橡胶刮下细胞；用PBS洗细胞两次，2000rpm×3min，用5mlPBS重悬细胞，即可用甩片机甩片或直接吸50μl点在载玻片上。 二、切片预处理（蛋白酶消化） 1. 试剂与配置 0.1mol/LTris-HCl(pH7.4) 缓冲液A：0.1mol/LTris-HCl(pH7.4)，0.3%Tween-20，0.5%NP-40 蛋白酶K：20-50μg/ml，溶于TE中 2. 操作方法 （1）干燥后的切片置于0.1mol/LTris-HCl(pH7.4)中，室温孵育5min； （2）浸入缓冲液A中，室温孵育10min； （3）滴加20μl蛋白酶K液于标本上，在湿盒中37℃孵育20min； （4）在室温下，用0.1mol/LTris-HCl(pH7.4)漂洗两次，每次5min。 三、原位扩增（以标记生物素为例） 1. 试剂与配置 PCR反应缓冲液：两种引物各100pmol，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各200μmol，Bio-dUTP50mol，1×PCR缓冲液； Tag酶：5U/μl 缓冲液B：0.01mol/LPBS，0.1%Triton-X100 指甲油（市售） 无水乙醇 2. 操作方法 （1）切片用1×PCR缓冲液平衡3次，每次5min； （2）用滤纸吸去切片上多余的液体，置60℃，每片加入30μlPCR反应缓冲液，5UTag酶，用盖玻片封片，四周封以指甲油，防止蒸发； （3）94℃变性5min，按下列条件（94℃×2min，55℃×2min，72℃×3min）循环20~25次后，72℃延伸5min； （4）玻片浸入无水乙醇中10min，以软化指甲油； （5）用刀片撬开盖玻片并除去； （6）用缓冲液B漂洗两次，每次3min； （7）用无水乙醇固定5min，并吹干。 四、检测（以ABC法为例） 1. 试剂与配置 缓冲液C：0.1mol/LTris-HCl(pH7.5)，0.1mol/LNaCl，2mmol/LMgCl2，0.5%Triton-X100 封闭液：3%BSA（溶于缓冲液C中） 显色液：0.05%DAB，溶于0.05mol/LTris-HCl(pH7.4)，临用前每10ml加30%过氧化氢50μl。 1%盐酸酒精液 苏木素染色液 2. 操作方法 （1）用30μl3%BSA滴加在玻片上，封闭1h； （2）用缓冲液C简洗1min，每片滴加ABC复合物20～30μl，室温放置40min； （3）缓冲液B室温漂洗3次，每次15min； （4）滴加显色液于玻片上，镜下观察控制显色时间（一般7～14min）； （5）流水洗片，浸入苏木素液中复染30s，1%盐酸酒精分化（提抽2次）； （6）常规脱水、透明、封片，镜下观察。 |
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发布于 ： 2021-07-26
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