一、材料

1.缓冲液与溶液

10X扩增缓冲液

氯仿

4种dNTP的贮存液（20mmol/L，pH8.0)

乙醇

MgCl₂(50mmol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V)

胎盘RNase抑制剂（20单位/μl)

2.酶与缓冲液

反转录酶（RNA依赖的DNA聚合酶）

热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶

3.凝胶

琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶

4.核苷酸与寡核苷酸

外源参考RNA

用于cDNA合成的寡核苷酸引物

oligo(dT）_12~18溶于TE(100μg/ml，pH8.0)

随机六核苷酸溶于TE(1mg/ml，pH8.0）

基因特异性寡核苷酸（20μmol)溶于水（终浓度20pmol/μl)

正义与反义寡核苷酸引物用于cDNA的PCR扩增


总RNA(100μg/ml)或带poly(A)⁺RNA(10μg/ml)溶于水中

1.一只盛有10~100个细胞的离心管，在4℃下离心5s，沉淀样品。

2.吸弃上清液，加10~20μl冰冷裂解液。非常轻微地振荡离心管，使细胞分散于裂解液中。

3.离心管在冰浴上放置5min,然后在4℃高速离心2min，上清液可直接用于RT-PCR的模板。

5.特殊设备

自动微量移液器的屏蔽型枪头

离心管（0.5ml,薄壁扩增反应专用离心管）或微量滴定板

正向排液式移液器

PCR仪

水浴箱水温设置在75℃和95℃

二、方法

1.转移1pg~100ng的poly(A)⁺RNA或10pg~1μg的总RNA到一只新的离心管。

用水调整体积至10μl；将RNA样品在75℃变性5min,将离心管迅速插入冰中冷却。

2.对含有这种变性的RNA样品的离心管内依次加入如下试剂：

10X扩增缓冲液                                     2μl

20mmol/L4dNTP混合液（pH8.0）    1μl

引物（最优先的，见下面）                   1μl

约20单位/μl胎盘RNase抑制剂           1μl

50mmol/LMgCI₂                                             1μl

100~200单位/μl反转录酶                     1μl

H₂O补足至                                         20μl

温育在37℃反应60min。MgCl₂为反转录酶作用所必需。

设置3支阴性对照管。在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第2支对照管加入除了反转录酶外的所有试剂；第3支对照管加入除了引物外的所有试剂。这些对照管进行所有后续的实验步骤。设置这些对照管能保证cDNA产物不是由于污染或由RNA的自身引导所致。

3.将反应管在95℃加热5min，使反转录酶失活和RNA-cDNA杂合物变性。

4.调整反应混合液体积以便正义和反义引物浓度在20pmol/L。

5.离心管内加入如下反应试剂：

1X扩增缓冲液（或调整反应体积至99μl）77μl

1~2单位热稳定DNA聚合酶                     1μl

6.如果PCR仪没有配置加热盖，在反应混合液的上层应加一滴矿物油（约50μl）。如果应用热启动PCR程序，在反应混合液的上层加一层石蜡油。放置离心管或微量滴定板在PCR仪上。

7.扩增反应有交性、复性和聚合（延伸反应）；相应的循环条件与温度列表如下：



8.抽取每种扩增样品5~10μl，用琼脂凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析扩增结果，用DNAMarker来判断扩增片段的大小。凝胶一般用EB(溴化乙锭）或SYBR金颗粒染色来观察扩增的量与片段大小。

9.若用矿物油覆盖在微量离心管内样品液体的上层（步骤6)，反应结束后可用150μl氯仿抽提去除。

10.把扩增产物克隆到已经制备好的相应的载体上。克隆之前，从扩增的DNA产物中分离去除残余的热稳定DNA聚合酶和dNTP。然后，DNA片段可以连接到一种平末端载体或T载体，或者用限制性内切核酸酶进行酶切后，再连接到具有相应末端的载体上。