差异DNA的PCR扩增实验
实验步骤 | 一、材料 1.缓冲液、溶液和试剂 dNTP溶液(包含所有4种dNTP,各10mmol/L) 2.酶和酶缓冲液 PCR反应缓冲液,10X 聚合酶混合液,50X(Advantage2,Clontech,或相当产品) 3.核酸和寡核苷酸 DNA样品(即方案2第16步中的各消减样品) 嵌套PCR引物NP1(10umol/L) 嵌套PCR引物NP2R(10umol/L) PCR引物PI(10umol/L) 来自方案1第4阶段第8步的未消减检测者对照 4.专用设备 热循环仪,预设至72°C 5.附加试剂 2%琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备 二、方法 1.初级PCR (1)每个稀释的DNA样品(即方案2第16步中的各消减样品,以及方案1第4阶段第7步中相应的稀释但未消减的检测者对照),各取1ul分装到准确标记的离心管中。冷冻的样品应该解冻,并在72°C温育,然后吹吸混匀再使用。 (2)另取一个离心管,为所有的初级PCR管配制一个主体混合液。按照下面的顺序将试剂混合。 灭菌水 19.5ul PCR反应缓冲液,10X 2.5ul dNTP溶液(10mmol/L) 0.5ul PCR引物PI(10pmol/L) 1.0ul 50X聚合酶混合液 0.5ul 总体积 24.0ul (3)取24ul主体混合液,分装到第1步准备的各反应管中。 (4)用1滴矿物油覆盖。 (5)在热循环仪中,将反应混合液74°C温育5min,以延伸接头。这一步「填充」接头所缺失的链,因而产生了PCR引物的结合位点。不要将样品从热循环仪中取出。 (6)立即开始下面的循环。 (7)从每个管中取4ul,在2.0%琼脂糖TAE凝胶上分析。 对于某些复杂的消减(复杂的组织或其核基因钽),建议分两步进行初级PCR,这样可以显著降低背景。首先,进行本方案所描述的初级PCR,然后按照方案4第1阶段笫10步所描述的步骤再进行一次初级PCR。最后再逬入次级PCR(方案3)。 2.次级PCR (8)每个初级PCR产物各取2ul,用38ul水稀释。 (9)从第1步稀释的各初级PCR产物中,各取lul,加到标记好的离心管中。 (10)按照下面的顺序将试剂混合,为次级PCR及一个附加反应的样品配制主体混合液。 灭菌水 18.54ul PCR反应缓冲液,10X 2.5ul 嵌套PCR引物NH(10umol/L) 1.0ul 嵌套PCR引物NP2R(10umol/L) 1.0ul dNTP溶液(10mmol/L) 0.5ul 50X聚合酶混合液 0.5ul 总体积 24.0ul (11)将24ul主体混合液分装至第2步的各反应管中。 (12)用1滴矿物油穎盖。 (13)立即开始下面的循环。 (14)从每个管中取4ul,在2.0%琼脂糖TAE凝胶上分析。 (15)反应产物应保存在-20°C。现在,这个PCR产物就富集了差异DNA。 如果不需要MOS,就可以直接进入「消减DNA的克隆」这一部分。 |
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发布于 : 2021-09-16
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