1)将5μL(2μg)打断的基因组DNA加入到一个硅化的1.5mL微量离心管中，冰水浴放置数分钟。剪切的DNA样品必须干净，如果DNA中混有其他污染物（如哌啶）将干扰反应。从6×10⁵个基因组（3×1O⁵个双倍体细胞核）出发可得到高质量、重复性好的足迹分析及测序反应。这相当于2μg小鼠（哺乳动物）基因组DNA。对于其他的物种，一般单倍体基因组数至少为6×10⁵,但是不同的基因组大小会导致相对应的DNA绝对量不同。

2)准备含引物I的第一链合成混合物，并于冰水浴上冷却数分钟。25μLDNA样品中，用移液器轻轻混匀，将样品再置于冰水浴中，样品管加上管扣以防在加热变性时管子爆开。

3)将DNA在95℃变性5min,引物在60℃复性30min,然后76℃延伸10min。正在合成第一链时，可以按步骤4准备溶液。第一链的合成在自动热循环仪上能很容易地自动进行，也可以手工在不同的水浴间转移。为了降低背景，应该使复性温度高于Tm值2℃左右，并且在76℃进行延伸。延伸步骤可以产生一个用于以后连接反应的平端（图15.3.1)。

4)在冰浴上融化20μmol/L的单侧接头混合物。配制连接酶稀释液，并配制不完整的连接酶混合物，但在步骤6前先不要加入接头及连接酶，所有液体均放置于冰水浴。

5)当步骤3中的延伸反应完成时，立即将样品放至冰浴，4℃稍加旋转离心以收集冷凝液滴，再置于冰水浴。

6)将步骤4准备好的不完整连接酶混合物中加入连接酶，混匀；再加入接头，混匀；放置于冰水浴。

7)往样品中加入20μL配制的连接酶稀释液，用移液器轻轻混匀，放置于冰水浴。加入25μL步骤6准备好的连接酶混合物，用移液器轻轻混匀，再放置于冰水浴上。4℃稍加旋转离心，17℃水浴过夜。

8)样品置于冰水浴数分钟，4℃稍加旋转离心，再置于冰水浴。

9)准备好沉淀盐溶液。往样品中加入9.4μL用于沉淀的盐混合物和220μL预冷的100%乙醇，颠倒混匀，-20℃下至少放置2h。

10)4℃离心15min沉淀连接反应物，弃上清。

11)加入500μL75%室温乙醇颠倒几次清洗管壁及沉淀，室温下离心5min,弃上清。用移液器吸去痕量乙醇液滴，晾干或者用Speedvac真空旋转蒸发器蒸发残存的乙醇。

12)加入70μL水并将样品置于室温以溶解沉淀，偶尔在涡旋混合器上振荡以促进溶解。每次振荡完毕，可离心2〜3s，以收集液滴。当沉淀溶解之后（通常<30min),将样品置于冰水浴上冷却。当溶解沉淀的时候，可以准备和预冷含有接头引物和引物2的扩增反应液。

13)往样品中加入30μL预冷的扩增反应液，用移液器轻轻混匀。样品再置于冰水浴。

14)往样品中加入3μL(1U)VentDNA聚合酶混合物，用移液器小心混匀。将样品再置于冰水浴。该反应对所用的VentDNA聚合酶的用量十分敏感，过量的聚合酶会导致很高的背景。

15)加入90μL矿物油覆盖样品，4℃稍加旋转离心，将样品再置于冰水浴。

16)进行18个PCR循环。第一步变性应为95℃3〜4min,随后的变性反应可为

1min；引物复性温度应高于Tm值0〜2℃(如果引物2和接头引物：Tm值不同，取较低的Tm值）；76℃延伸3min,每个循环的延伸步骤另补加5s；最后一步延伸10min。反应完毕，将样品置于冰水浴，取下管扣（如果使用的话)，4℃稍加旋转离心，收集冷凝液滴。将样品置于冰水浴。

本步骤中最重要的参数就是变性温度。如果温度太低就会发现没有信号或序列梯度缩短，如果温度太高就会使聚合酶失活。

17)准备含有标记引物3的末端标记混合物，置于冰水浴中预冷数分钟。取5μL加入样品中，用移液器温和混匀水相时，样品管应尽可能多地置于冰水浴中，4℃稍加旋转离心，再置于冰水浴

注意：标记混合物含相当大量的32P，操作和弃置样品及混合物时应格外小心。

18)进行两轮PCR以标记DNA。第I次变性反应为95℃3〜4min；第2次变性为95℃1min。末端标记引物3的复性温度应高于其计算的Tm值0〜2℃，复性2min；76℃延伸10min。当第2个延伸反应结束时，将样品放置于冰水浴。

19)将样品置于室温，然后迅速加入295μLVentDNA聚合酶终止液，在涡旋混合器上振荡混合，稍加旋转离心，以收集粘在管壁和顶部的放射性液滴。加入500μL酚/氯仿/异戊醇，用力摇匀或振荡混合。室温离心3〜5min。将上层水相（约400μL,避免混入界面物质）转移到一个干净的经硅化的1.5mL微量离心管中，充分混匀，稍加旋转离心，收集管壁上的液滴。

20)准备4个干净的经硅化的1.5mL微量离心管，每管中加入235μL室温100%乙醇和94μL水相，在涡旋混合器上振荡以充分混匀。-20℃放置至少2h。弃去所有剩下的水相。

21)将沉淀样品在4℃离心15min，弃上清。

22)加入500μL室温75%乙醇，在涡旋混合器上振荡。样品在室温离心5min,弃上清。用移液器吸去痕量乙醇，然后晾干或用Speedvac蒸化器蒸发残余的乙醇。

23)每管中加入7μL加样缓冲液，室温放置，偶尔在涡旋混合器上振荡以帮助溶解沉淀，每次振荡后，可稍加旋转离心2〜3s，以收集管壁上的液滴。样品一般很快就溶解（5min以内）。可用一根吸管从中吸出液体检査样品是否已完全重悬，并用盖革计数器确定放射性是在样品里而不是留在管里，将样品再放回原管。如果仍有大于总放射量的10%留在管里，振荡，离心，重复上述操作。

24)将样品在85〜90℃变性5min后，将每管中全部样品加样于6%测序胶上进行电泳，电泳完毕固定并干燥胶，然后不加增感屏放射自显影6〜24h。因为加入了25bp的接头，测序梯级应比原始的足迹或测序产物长25bp。